a Общая схема реакции интеграции транспозаз семейства TnsB. Активный центр DDE катализирует атаку H ₂ O на концах транспозона. Прямая атака 3’ОН груза ДНК на сайт ДНК-мишени приводит к образованию комплекса переноса цепи (STC). Промежуточный продукт Шапиро разрешается репликацией, производящей дупликацию сайта-мишени и коинтеграцию ²⁵ , которые могут быть разрешены с помощью RecA или резолвазы. b Архитектура белка shTnsB. c Карта плотности крио-ЭМ с глобальным разрешением 2,46 Å TnsB (STC) в посткаталитическом состоянии (см. Также дополнительные рисунки 6–7, дополнительную таблицу 2). Карта окрашена в соответствии с карикатурой, описывающей строение на панели d . д Мультфильм ШТнсБ-СТЦ. Комплекс состоит из 4 протомеров shTnsB и 6 олигонуклеотидов ДНК, представляющих посткаталитическое состояние STC (панель 9).1329 и ). С этой точки зрения целевая ДНК расположена вверху структуры, а более длинные концы транспозона расположены внизу. На схеме отмечены непереносимая цепь (NTS) и переносимая цепь (TS) транспозона. Пунктирные линии изображают взаимодействие между MD и NTD1 из-за кривизны ветвей ДНК. e Ленточная диаграмма, показывающая обзор сборки ШТнсБ-СТЦ.

Полноразмерное изображение

Результаты

Выделение shTnsB и создание комплекса переноса цепи (STC)

Рекомбинантный белок shTnsB был экспрессирован в E. coli и очищен с использованием комбинации аффинной и эксклюзионной хроматографии (SEC). Белок вел себя как мономер в SEC-MALS с молекулярной массой 68 кДа (дополнительные рис. 2a, b, методы). Мы проанализировали его ДНК-связывающие свойства с помощью EMSA с использованием олигонуклеотидов с разным количеством коротких и длинных концевых повторов (SR и LTR соответственно), присутствующих на левом и правом концах (LE и RE) последовательностей транспозонов (дополнительная рис. 2c, г, дополнительная таблица 1). Анализ сдвигов полос со всеми различными субстратами выявил лестницу дискретных полос, относительная подвижность которых обратно зависела от концентрации белка, предполагая связывание одного белкового мономера на повтор. Сборки выше шести или семи белков не наблюдались, поскольку их размер препятствовал попаданию в акриламидный гель (дополнительный рисунок 2c). Затем мы проверили, может ли shTnsB независимо связывать RE или LE. Оба комплекса, shTnsB-RE и shTnsB-LE, были обнаружены, что указывает на то, что присутствие обоих концов не требуется для связывания shTnsB с повторами (дополнительный рисунок 2d). Точно так же количество полос, наблюдаемых при смешивании shTnsB с RE, соответствует 5 сайтам связывания TnsB. Однако количество полос, обнаруженных при смешивании shTnsB с LE, составило 4, т.е. на одну больше, чем ожидаемые три сайта связывания. Это можно объяснить взаимодействием двух комплексов shTnsB:LE, подобным тому, которое наблюдается в комплексе STC (рис. 1), или в других структурах транспозазы, не связанных с ДНК-мишенью, например, в Tn5 ¹⁹ . Однако агрегация комплекса shTnsB:LE также может вызывать сдвиг полосы и не может быть исключена как возможность. Наконец, мы проверили связывание shTnsB с двухцепочечной ДНК, содержащей только LTR (6)-SR (1) (дополнительный рисунок 2e), и, как и ожидалось, обнаружили две полосы, соответствующие двум сайтам связывания shTnsB. Кроме того, мы инкубировали этот комплекс в буфере, содержащем различные концентрации NaCl, при 37 и 45 °C, чтобы определить, могут ли эти переменные изменить аффинность shTnsB. Однако на ассоциацию эти изменения не повлияли. В целом, результаты EMSA показали, что shTnsB связывает каждый повтор, присутствующий как в RE, так и в LE, независимым от груза способом.

Первоначально мы подготовили сетки крио-ЭМ и собрали данные, используя образец, содержащий shTnsB, а также RE и LE (т.е. две последовательности двухцепочечной ДНК, одна с последовательностью RE и одна с последовательностью LE без груза, дополнительный рисунок 2e). Эта выборка была неоднородной и страдала преимущественной ориентацией. Обработка этих данных привела к реконструкциям с низким разрешением недостаточного качества для построения модели атома (дополнительный рисунок 3). Однако можно было наблюдать два выступа, связанных с удлиненной плотностью, что свидетельствует о присутствии двух протомеров shTnsB, связанных с поверхностью двухцепочечной ДНК набора SR-LTR. Удлиненная плотность, приписываемая ДНК, изгибается таким же образом, как в недавно опубликованной структуре RE-связанного ecTnsB 9.1259 18 , что также подтверждает, что карта с низким разрешением соответствует комплексу перед транспозицией.

Чтобы стабилизировать комплекс shTnsB-ДНК, мы разработали олигонуклеотиды для восстановления STC, то есть состояния, представляющего посттранспозицию, а не претранспозицию, как описано выше (Методы, дополнительная таблица 1 и дополнительная рис. 4). Целевые последовательности для восстановленного комплекса были выбраны на основе природных последовательностей, фланкирующих сайт прикрепления в геноме S. hofmannii UTEX 2349. Эта стратегия аналогична той, которой следовали для получения структуры транспозосомы Р-элемента ²⁰ , за исключением того, что в ней используется не симметричная ДНК STC, а природные асимметричные последовательности STC S. hofmannii UTEX 2349 , чтобы представить родной комплекс. ДНК STC состоит из двух перенесенных цепей (TS) и неперенесенных цепей (NTS), представляющих LTR(8)-SR(5) и SR(1)-LTR(6) двухцепочечную ДНК, связанную с сайтом прикрепления CAST (дополнительная рис. 4). Расстояние 5  п.н. между сайтами вставки LTR(8)-SR(5) и SR(1)-LTR(6) было выбрано, поскольку транспозиция CAST вызывает дупликацию 5  п.н. в сайте вставки 9.1259 21 (рис. 1а).

Воссозданная ДНК STC была смешана с очищенным белком, и сборка комплекса shTnsB-STC была проверена с помощью SEC-MALS (дополнительный рисунок 2b). Наблюдали два пика: пик с более низкой молекулярной массой содержал несвязанный белок и ДНК, использованные при восстановлении, в то время как пик с высокой молекулярной массой, который элюировался при 358,7 кДа, очень хорошо совпадал с ассоциацией ДНК STC (104,6 кДа) и 4 протомеров shTnsB (68 кДа), теоретическая молекулярная масса которого составляет 376,6 кДа. Эта сборка была подвергнута анализу отдельных частиц с помощью крио-ЭМ, в результате чего была получена карта с разрешением 2,46 Å, на которой мы построили атомную модель комплекса shTnsB-STC в его посткаталитическом состоянии (рис. 1а).

Общая структура комплекса shTnsB-STC

Полипептид shTnsB состоит из N-концевого домена, который можно разделить на два субдомена (NTD1 и NTD2), каталитического домена DDE (DDE), среднего домена (MD) , домен олигомеризации (OD) и С-концевой домен (CTD) (рис. 1b). Архитектура shTnsB напоминает архитектуру Mu-транспозазы (MuA) ²² , хотя идентичность последовательности ограничена каталитическим доменом DDE (дополнительный рисунок 1a). Мы собрали 4728 фильмов и установили координаты для 90,6 миллиона частиц, которые были уменьшены до 415 тысяч после 2D-классификации. Используя этот набор частиц, мы выполнили неравномерное уточнение, трехмерный анализ изменчивости и последующее гетерогенное уточнение в cryoSPARC ²³ . Этот подход дал две карты при 2,5 и 2,8 Å. Дальнейшие этапы уточнения и трехмерного анализа изменчивости с использованием 260 тыс. частиц карты 2,5 Å позволили создать крио-ЭМ-карту с глобальным разрешением 2,46 Å, что позволило смоделировать комплекс shTnsB-STC (рис. 1c, дополнительные рис. 5–7, Дополнительная таблица 2 и методы). Однако большая гибкость ДНК поставила под угрозу визуализацию концов ДНК, содержащих SR (5) и SR (1), что не позволило определить возможные контакты с shTnsB (дополнительный рисунок 7, дополнительный фильм 1 и дополнительная таблица 1).

Структура комплекса shTnsB-STC напоминает вытянутую букву X с изогнутыми плечами разной длины. Более длинные плечи соответствуют концам транспозона, а короткие — изогнутой ДНК-мишени (рис. 1г, д, 2а). Четыре протомера shTnsB (shTnsB1-4) представляют собой переплетенную сборку на ДНК STC. Белок находится в двух разных конформациях, чтобы ассоциироваться с ДНК STC и строить комплекс (рис. 2b). shTnsB1 и 2 изображают вытянутую конформацию вдоль разветвленной структуры нуклеиновой кислоты, в которой мы не смогли обнаружить домены OD и CTD (рис. 1б, г). В обоих протомерах каждый из доменов NTD1 и NTD2 связан с LTR(8) и LTR(6), а каталитический домен DDE визуализируется в транс-положении на стыке ДНК-мишени и концов транспозона. Такое расположение каталитического домена в транс-положении является обычным при транспозиции ДНК, поскольку оно делает расщепление фосфодиэфира зависимым от сборки комплекса (рис. 1e, 2b). Со стороны ДНК-мишени сборка стабилизируется за счет взаимодействия остова с доменами MD и DDE протомеров shTnsB1 и 2 (R416, Q427, K29). 0, N428) (рис. 2б). Таким образом, shTnsB1 осуществляет распознавание ДНК на конце LTR(8), а его домен DDE катализирует атаку 3´OH в ответвлении LTR(6) на ДНК-мишень, способствуя реакции переноса цепи. Симметричное расположение ДНК STC наблюдается для shTnsB2, который катализирует перенос цепи LTR(8) на другую цепь ДНК-мишени (рис. 1а, 2б).

a На верхней панели показана схема S. hofmannii подвижный элемент с левым и правым концами (LE и RE) с каждой стороны ДНК-груза. Сильный цветовой тон показывает область каждого элемента, присутствующего в структуре. Нижняя панель не включает белковые фрагменты в структуру и показывает ДНК STC. ДНК окрашена по верхней схеме для LE и RE, а участок ДНК-мишени показан серым цветом. Желтые точки указывают сайт, где произошла прямая атака 3′-ОН на ДНК-мишень, чтобы способствовать реакции переноса цепи. b Подробное изображение ассоциации протомера shTnsB с ДНК STC. Две различные ассоциации наблюдаются для молекул shTnsB. Различные участки ДНК, взаимодействующие с белками, показаны соответствующим ярким цветовым оттенком. c Подробное изображение спиральных доменов NTD1 и 2, показывающее специфические взаимодействия с основаниями ДНК в области LTR(6). Маркировка нуклеотидов соответствует цветовому коду на рис. 1d, e (см. также рис. 1d и дополнительный рис. 8).

Изображение полного размера

Протомеры shTnsB3 и 4 расположены в другой конформации с небольшим количеством контактов с остовом ДНК (рис. 2б). Домены NTD1 и NTD2 этих протомеров не обнаружены в нашей структуре, что свидетельствует об их высокой подвижности. Кроме того, домен DDE вытягивается из ДНК, в то время как MD размещает области NTS с концов LTR (6) и LTR (8) после катализа. Структура выявила важную роль этих двух протомеров в ассоциации shTnsB1 и shTnsB2 с ДНК, поскольку в этой конформации они демонстрируют упорядоченный домен OD. Спираль между S502 и S522 не наблюдается в shTnsB1-2, но в конформации, принятой shTnsB3-4, спираль облегчает сборку комплекса STC за счет переплетения NTD2 shTnsB1 и shTnsB2 с доменом DDE противоположного протомера. в каждой ветви ДНК, тем самым связывая распознавание двух концов транспозона с каталитическими сайтами shTnsB1-2 (рис. 1d, 2b).

Распознавание shTnsB-ДНК

Распознавание LTR(6) и LTR(8) осуществляется спиральными доменами NTD1 и 2 субъединиц shTnsB1 и 2 (рис. 2c). Структура домена NTD1 обнаруживает спираль-поворот-спираль Myb/гомеодомен-подобную складку. Этот домен является членом суперсемейства гомеобоксных факторов транскрипции ²⁴ . Прямые контакты оснований с помощью спирали, связывающей большую бороздку, в основном объясняют специфичное для последовательности распознавание. R77, который хорошо консервативен в гомологах цианобактерий и в Tn5053, но заменен лизином в MuA и аланином в ecTnsB (дополнительная рис. 1), образует полярные контакты с dG37, тогда как R81 связывается с основаниями последовательных нуклеотидов dG36 и dT37. на комплементарной цепи LTR (6) в LE (дополнительные рис. 7, 8 и дополнительная таблица 1). Другие остатки, взаимодействующие с ДНК (R58, R66, K84 и T78), обнаруживают полярные взаимодействия с остовом обеих цепей ДНК.

NTD1 соединен с NTD2 длинной петлей, которая проходит вдоль бороздки ДНК. Домен NTD2 функционально аналогичен второму ДНК-связывающему домену в других транспозазах. Однако он демонстрирует ограниченную консервативность по отношению к ближайшим гомологам shTnsB (дополнительный рисунок 1), а его структура напоминает парный домен, обнаруженный в генах парного ящика (Pax). Хорошо консервативный R99 в этой петле создает полярные взаимодействия с основаниями dT31 и dA32 и dA45, в то время как R106 также распознает основания dT30 и dT46 в разных цепях. Остальные ассоциации петли с ДНК включают остовные контакты. Домен NTD2 также связывается с ДНК в большой бороздке. Однако он отображает меньше конкретных контактов с базами. Только R158 и K154 связаны с dA48-dG49.и dG24 соответственно, тогда как остальные остатки связаны с остовом нуклеиновой кислоты. Эти взаимодействия аналогичны в доменах NTD1 и 2 на ветвях LTR (6) и LTR (8) комплекса белок-ДНК (дополнительная рис. 7).

Сборка комплекса белок-ДНК

Домены NTD2 субъединиц shTnsB1-2 соединены с доменами DDE длинной петлей. Переплетающаяся конформация этих протомеров с ДНК позволяет shTnsB1, который распознает ДНК в LTR(8), катализировать реакцию переноса цепи на конце LTR(6), и наоборот для shTnsB2 (рис. 1c, 2b). Этому перекрестному расположению каталитических доменов DDE способствует конформация молекул shTnsB3-4, которые стабилизируют сборку за счет интеркалирования длинной двудольной спирали, которая собирает домены NTD2 и DDE разных субъединиц. Соседний MD вмещает 5 ′ NTS (рис. 1d, рис. 3a–c). С-концевая спираль OD плотно прилегает между доменом DDE shTnsB2 и NTD2 shTnsB1 сетью контактов, сочетающих полярные и неполярные взаимодействия (рис. 3b), причем первая на конце (E360-K520 ), средний (R367-D512-Q508) и начальный (h372-S505) участки спирали. Другое сильное полярное взаимодействие наблюдается между боковыми цепями D514 в OD и R137 в NTD2. Короткая петля соединяет этот участок с N-концевой спиралью OD. Взаимодействие второй спирали OD с доменом DDE стабилизируется за счет неполярных взаимодействий, а группа остатков в MD shTnsB3 (R416, Q425, N428) вместе с R174 и R179в shTnsB2 образуют электроположительно заряженную область, стабилизирующую основания 5′-выступа (рис. 3c). Наконец, домены MD и DDE протомера shTnsB3 связаны с NTD1 shTnsB2, главным образом, группой неполярных взаимодействий. Интересно, что N-концевая β-цепь shTnsB2 встроена в качестве дополнительной цепи в антипараллельный β-лист MD (рис. 3d). Дополнительные полярные взаимодействия боковых цепей (E422-K169, N462-K102 и E54-h383) дополняют эту ассоциацию. В целом, описанные здесь ассоциации очень похожи в случае shTnsB4 с shTnsB1 и 2. Отметим, что взаимодействия между shTnsB3 и 4 в комплексе shTnsB-STC не наблюдается.

a Обзор архитектуры протомеров shTnsB и взаимодействий между двумя типами конформаций, наблюдаемых для белка на одной из ветвей ДНК STC (прозрачно). Цветные овалы обозначают увеличенные области на других панелях. b , c Детальное изображение взаимодействий OD shTnsB3 с доменами NTD2 и DDE shTnsB1 и 2 соответственно. д Увеличение области LTR(6), изображающей ассоциацию N-концевого β-листа NTD1 с MD shTnsB3.

Изображение полного размера

В совокупности эта сеть взаимодействий вдоль Х-образного комплекса предполагает, что различная конформация протомеров shTnsB1-2 и shTnsB3-4 благоприятствует транс-архитектуре, скорее всего, как стратегии связывания белок-ДНК. комплексная сборка с катализом ДДЕ.

Каталитический домен DDE

Транспозазы из нескольких суперсемейств обладают каталитическим доменом, содержащим триаду кислых аминокислот (DDE или DDD) ^25,26 . Этот белковый модуль катализирует реакцию транспозиции, при которой элемент вырезается из донорского сайта и вставляется в геном или в мобильный генетический элемент. Мутации в этих каталитических остатках показали их критическую роль в транспозиции в доменах DDE транспозаз Tn5 и Tn10 ^27,28 . Интеграция элементов в новое место генома обычно приводит к короткой дупликации сайта-мишени из последовательностей хозяина (2–10  п.н.). В shTnsB мотив DDE состоит из двух остатков аспарагиновой кислоты (D205, D287) и остатка глутаминовой кислоты (E321), расположенных в консервативном ядре, образующем характерную РНКазу Н-подобную складку, объединяющую α-спирали и β-цепи (рис. 4а, дополнительный рис. 8е). Трехмерная структура триады ДДЭ образует каталитический карман, который связывается с ионами двухвалентного металла, которые помогают в различных нуклеофильных реакциях во время расщепления ДНК. Домены DDE четырех молекул shTnsB в сборке очень хорошо накладываются друг на друга (среднеквадратичное отклонение 0,59).Å среднеквадратичное значение более 160 Cα). Однако карман DDE демонстрирует два разных расположения в зависимости от конформации протомера shTnsB в комплексе STC (рис. 1). Карманы DDE shTnsB3 и 4 не контактируют с ДНК, и каталитические остатки этих субъединиц не расположены должным образом для реакции расщепления (рис. 4b). В случае shTnsB1 и 2 они обнаруживают каталитический карман DDE после завершения реакции переноса цепи. Можно визуализировать дополнительную плотность в кармане (рис. 4а), которую можно отнести к H ₂ O или Mg ²⁺ . E321 находится на расстоянии 6 Å, так как структура захватывается в посткаталитическом состоянии. Расстояния дополнительной плотности до D205, D287 и фосфатов основной цепи позволяют предположить, что плотность может быть отнесена к молекуле H ₂ O, образующейся после 3′-OH-атаки одной из цепей мобильного элемента на ДНК-мишень. (рис. 1а, 4а, дополнительный рис. 8).

a В обведенной области находится один из каталитических центров в комплексе shTnsB-STC. Увеличение области показывает конформацию каталитического центра после катализа. Предполагаемая молекула воды и расстояния до соседних каталитических остатков и ДНК показаны в Å. b Наложение доменов DDE двух конформаций, обнаруженных в комплексе белок-ДНК для shTnsB. c Суперпозиция доменов DDE shTnsB2 и 3 с ecTnsB (PDB: 7PIK) и основным доменом MuA (PDB: 1BCO). СКО для суперпозиции находятся в диапазоне от 0,7 до 1,2 Å для 160 и 250 Cα. d Нижняя панель показывает, что, несмотря на высокое структурное сходство доменов DDE, единственной субъединицей во всех этих структурах, которая демонстрирует компетентный каталитический карман, является shTnsB2, которая является единственной, связанной с ДНК.

Изображение полного размера

Несмотря на различия в последовательностях, новая структура комплекса распознавания концов транспозона Tn7 ecTnsB транспозазы ¹⁸ обеспечивает функциональный гомолог для сравнения. Домен DDE является наиболее консервативным модулем shTnsB, и поиск гомологов shTnsB DDE с использованием DALI ²⁹ выявил домены ecTnsB и транспозазы фага Mu как наиболее близкие структурные гомологи вместе с различными вирусными интегразами (SRV, HIV- 1, ВТЛВ-1). Сравнение двух конформаций shTnsB с этими белками показало, что ядро ​​домена очень хорошо накладывалось на другие интегразы (рис. 4c), но только каталитический карман shTnsB1-2 показал триаду кислых аминокислот на соответствующих расстояниях для катализа реакция переноса цепи (рис. 4d). В остальных случаях каталитические остатки не были правильно расположены. Примечательно, что протомеры ecTnsB в комплексе распознавания концов имеют конформацию, сходную с протомерами shTnsB3 и 4 в STC. Однако в последнем ДНК-связывающие домены этих двух субъединиц не визуализировались (рис. 1–2), что позволяет предположить, что высокая гибкость, наблюдаемая в дистальных отделах ДНК STC (дополнительный фильм 1), нарушает их связывание с SR(1) и SR(5) области LE и RE.

В совокупности структурное сравнение показывает, что домен DDE поддерживает очень хорошо сохранившуюся трехмерную структуру; однако сравнение различных структурных гомологов предполагает, что архитектура каталитического кармана транспозазы устроена правильно, как только она связывается с ДНК-мишенью.

Связывание ДНК транспозазами shTnsB, ecTnsB и MuA

Белок shTnsB проявляет гомологию с транспозазами ecTnsB и MuA. Однако, помимо домена DDE, между ними сохраняется несколько остатков (дополнительный рисунок 1). Эти различия особенно очевидны в ДНК-связывающих доменах, где многочисленные выравнивания последовательностей из нескольких канонических белков Tn7 TnsB и различных классов CAST-элементов показали существенное расхождение ¹⁸ . NTD1 shTnsB демонстрирует значительное трехмерное сходство с доменом HTH DBD1 в ecTnsB (RMSD 2,4 Å для 66 Cα) и доменом Iβ MuA (RMSD 2,8 Å для 62 Cα). Тем не менее, присутствие N-концевой β-цепи (N32-T36) исключает shTnsB, и эта область играет важную роль в построении сборки комплекса STC (рис. 3d). Эта структурная особенность не наблюдается в комплексе MuA-STC ²² , единственной доступной до сих пор структуре прокариотического комплекса транспозазы STC (рис. 5).

ДНК-связывающие домены трех различных транспозаз выровнены по ДНК (PDB: 8AA5, 7PIK и 4FCY соответственно). В случае MuA показаны одни и те же домены, связанные с разными повторами. Для shTnsB были построены только домены протомеров 1 и 2. В случае ecTnsB изображен ДНК-связывающий домен одной из субъединиц концевого комплекса транспозона.

Полноразмерное изображение

Интересно, что домен NTD2 shTnsB не проявляет трехмерного сходства с его аналогами в транспозазах ecTnsB и MuA (рис. 5). Вместо этого NTD2 хорошо накладывается на Pax6, фактор транскрипции, содержащий двудольный спаренный ДНК-связывающий домен (RMSD 2,8 Å для 60 Cα), который играет важную роль в развитии глаза, носа, поджелудочной железы и центральной нервной системы ³⁰ . Удлиненный линкер, соединяющий NTD1 и 2, частично визуализируется в ecTnsB и не наблюдается в ДНК-связывающих доменах MuA (рис. 5). Этот линкер образует контакты малой бороздки, а карбоксиконцевая единица спираль-поворот-спираль образует контакты основания в большой бороздке, как это наблюдается в комплексе shTnsB-STC (рис. 5).

Сравнение позволяет предположить, что белки TnsB имеют общий общий способ связывания ДНК, включая два домена, которые распознают разные SR и LTR в сборке. Однако домены, участвующие в связывании, претерпевают различные структурные вариации для осуществления специфических взаимодействий белок-ДНК для каждой транспозазы. Это разнообразие может быть необходимо для размещения последовательностей большого количества Tn7-подобных элементов, предотвращая распознавание транспозазами последовательностей ДНК, принадлежащих другим транспозонам ³¹ .

Комплексы STC

Структура концевого комплекса транспозона ecTnsB предоставила информацию о распознавании концов транспозона ¹⁸ , но до сих пор нет структурной информации об их комплексе STC. Конформация субъединиц ecTnsB в концевом комплексе транспозона напоминает расположение, принятое доменом DDE протомеров shTnsB3 и 4 в комплексе shTnsB-STC. Однако положения доменов MD и OD ориентированы по-разному (рис. 4c). Тем не менее, эта конформация сильно отличается от архитектуры протомеров 1 и 2 shTnsB, которые участвуют в катализе реакции переноса цепи (рис. 2b). Конформация этих субъединиц больше похожа на аналоги в комплексе MuA-STC (рис. 6а).

a Комплексы shTnsB-STC и MuA-STC показаны в той же цветовой схеме, что и на рис. 1, за исключением ДНК, окрашенной в белый цвет. b Обведенные кружками области на обоих комплексах сравниваются, чтобы показать ключевые различия в сборке комплексов STC.

Полноразмерное изображение

Хотя последовательность shTnsB отдаленно связана с транспозазой фага MuA (дополнительная рис. 1), общая ассоциация комплекса MuA-STC имеет сходство с белком CAST (рис. 6a). Однако сборка также имеет важные отличия. Одно из основных отличий заключается в том, что в комплексе MuA-STC ДНК-связывающие домены субъединиц, участвующих в сборке (MuA 3 и 4), связаны с соответствующими повторами в LE и RE (рис. 6а), тогда как в шТнсБ-СТЦ их нельзя было смоделировать, что свидетельствует об их высокой гибкости. Это мнение подтверждается высокой изменчивостью, наблюдаемой во внешней части Х-образной структуры ДНК (дополнительный фильм 1). Тот факт, что эти области структуры MuA-STC ²² участвуют в контактах кристаллов, что может снижать гибкость, облегчая тем самым связывание доменов Iβ и Iγ с повторами на LE и RE концах.

Любопытно, что ассоциация уникальной N-концевой β-цепи NTD1 в shTnsB не наблюдается в MuA (рис. 6а, б, верхние панели), поскольку этот элемент вторичной структуры отсутствует ни в домене Iβ MuA, ни в DBD1 ecTnsB. Это наблюдение предполагает, что в комплексе ecTnsB-STC эта ассоциация не может происходить. Другое важное отличие возникает из-за сборки комплекса, в котором домен OD в shTnsB интеркалирует с множественными взаимодействиями между NTD2 и каталитическим доменом DDE, создавая ассоциацию между белками shTnsB. В случае MuA ассоциация между четырьмя протомерами в этой области комплекса STC отличается, демонстрируя значительно меньше взаимодействий между разными доменами (рис. 6b). Кроме того, в протомерах 1 и 2 комплекса shTnsB-STC домены OD не наблюдаются, тогда как в случае MuA спирали в домене IIIα перекрещиваются внутри V-образного участка ДНК-мишени (рис. 6а). ). Нельзя было не учитывать возможность того, что взаимодействие между этими спиралями в структуре MuA происходит за счет кристаллических контактов.

Эффект связывания ДНК при транспозиции

Чтобы подтвердить взаимодействие shTnsB:ДНК в STC, мы протестировали транспозиционную активность ряда мутантов с заменой, в которых консервативные аминокислоты, демонстрирующие полярные взаимодействия с ДНК, были заменены аланином (рис. 7, дополнительный рис. 1). Мы мутировали R77, R81 (оба присутствуют в NTD1), R99 (присутствуют в линкере между NTD1 и NTD2), R158 (присутствуют в NTD2), R188, R223, K290 и R380 (присутствуют в домене DDE) (рис. 7b). . Мутанты R77A, R81A и R158A продемонстрировали резкое влияние на активность транспозиции «на-мишень», предполагая, что shTnsB больше не может распознавать повторы в RE и LE (рис. 7b). Примечательно, что нуклеотиды, участвующие в этом взаимодействии (дополнительная рис. 7), сохраняются между различными повторами, что еще раз подтверждает важность этого взаимодействия в распознавании ДНК донора ²¹ . Что касается R99, хотя он и присутствует в неупорядоченной области shTnsB, он тесно взаимодействует с фосфатным остовом и основаниями LTR. Эти нуклеотиды также консервативны в наборе повторов RE/LE ²¹ . Однако эффект его замены был переменным: повторы демонстрировали либо более высокую, либо более низкую активность, чем дикий тип. В случае R223A и ​​R380A это также повлияло на активность. Эти остатки, по-видимому, участвуют в стабилизации состояния после транспозиции. R223 взаимодействует с центральными нуклеотидами последовательности 5 bp между никами, образованными транспозицией, тогда как R380 взаимодействует с нерасщепленной одноцепочечной ДНК транспозона, расположенной вне комплекса. Наконец, несмотря на свою консервативность и близость к сайту прикрепления, мутанты R188A и K290A не отменял целевую транспозицию. Наши результаты подтверждают функциональную важность этих остатков, участвующих в распознавании LTR и стабилизации STC, и указывают на возможные сайты для улучшения свойств транспозазы для целей инженерии генома.

a Транспозицию проводили путем трансформации бактерий плазмидой, содержащей сайт-мишень, показанный зеленым цветом, распознаваемым Cas12k:sgRNA (pTarget), плазмидой, содержащей донорную ДНК с последовательностями CAST RE и LE, показанными красным ( pDonor) и плазмиду, содержащую кодирующие последовательности sgRNA, Cas12k, TnsC, TniQ и TnsB (pHelper). Интеграцию донорной последовательности в pTarget количественно определяли с помощью количественной ПЦР с использованием набора праймеров, амплифицирующих область pTarget, в которой не происходит транспозиции (PF 9).1331-мишень и PR _{-мишень} ) и набор праймеров, которые амплифицируют область между последовательностями LE-мишени и донора (продукт PF _{и продукт} PR ). b Положение выбранных аминокислот в STC, подлежащих мутации и тестированию на транспозиционную активность. c Кратность изменения активности, измеренная с помощью количественной ПЦР для каждого мутанта TnsB. Для каждого мутанта проводили две или три биологические повторности. Отдельные точки данных, представляющие все технические повторы, обозначены точками. Столбцы представляют собой среднее значение кратности изменения активности, а усы, расположенные вокруг него, представляют собой стандартное отклонение. Активность дикого типа представлена ​​пунктирной линией. Данные предоставляются в виде файла исходных данных.

Изображение в натуральную величину

Обсуждение

В прошлом году мы стали свидетелями значительного увеличения структурных знаний систем CAST. Доступна структурная информация TnsC, TniQ и Cas12k типа V-K ^32,33,34 , а также каскадного комплекса типа I-F, связанного с TniQ ^35,36 . Однако, несмотря на эти достижения, нам необходимо точное понимание последовательности взаимодействий и промежуточных звеньев, ведущих к точной вставке ДНК-груза, чтобы решить возможную разработку систем CAST. Это отсутствие полного понимания того, как транспозиция осуществляется с помощью различных CAST, препятствует их повторному использованию для точной вставки ДНК в инструменты редактирования генов. Тип В-К мог представлять собой перспективную систему для развития этих средств за счет уменьшенного количества и размеров ее компонентов. Однако для этой цели необходимо решить проблему образования коинтегратов (рис. 1а).

Концевой комплекс транспозона shTnsB с низким разрешением (дополнительный рисунок 3) предполагает, что распознавание конца транспозона аналогично ecTnsB ¹⁸ ; однако высокая гетерогенность и гибкость сборки не позволили провести детальную молекулярную характеристику распознавания ДНК. Это согласуется с экспериментами в системе ecTn7, которые показали, что пре-транспозиционный комплекс менее стабилен, чем пост-транспозиционный комплекс, и что защита транспозонов меняется между пре- и посткаталитической стадиями ^17,37 . Кроме того, эксперименты EMSA предполагают, что shTnsB может взаимодействовать с RE и LE в прекаталитическом состоянии в отсутствие ДНК-мишени (дополнительный рисунок 2). Таким образом, взаимодействие shTnsB с концами транспозона, по-видимому, не зависит от присутствия других компонентов системы CAST типа V-K. Более высокая стабильность посткаталитических комплексов привела нас к сборке shTnsB-STC, которую мы смогли определить с высоким разрешением. Этот комплекс представляет собой стадию после завершения реакции переэтерификации с ДНК-мишенью, обнаруживающую ее трехмерную сборку. Общая структура напоминает архитектуру транспозосомы 9 фага MuA.1259 22 . Тем не менее, можно наблюдать ключевые различия между сборками, особенно в домене NTD2 (рис.  6). Одно сходство между shTnsB и MuA, которое отличает их от системы Tn7, заключается в том, что типы V-K и Mu используют репликативную транспозицию, которая требует расщепления только одной цепи ДНК, в то время как Tn7 выполняет реакцию вырезания и вставки, включающую расщепление неперенесенной цепи TnsA. Следовательно, структурное сходство общего комплекса STC между shTnsB и MuA будет поддерживаться этими механистическими сходствами. Тем не менее, представляется затруднительным установить аналогии возможной комплексной сборки STC ecTnsB 9.1259 18 с использованием структуры shTnsB-STC, так как мы ожидаем, что ecTnsB-STC также должен вмещать ecTnsA ¹⁰ . То же самое может быть экстраполировано для CAST типов I-F и I-B, которые включают в свой состав TnsA.

Посткаталитическая структура shTnsB-STC выявила очень мало оснований-специфических контактов белок-ДНК (дополнительная рис. 7), как это также наблюдалось в прекаталитическом комплексе ecTnsB ¹⁸ . Домен NTD1 в shTnsB частично имеет такую ​​же архитектуру, что и его аналоги в ecTnsB и MuA, в то время как NTD2 уникален в том смысле, что он имеет структурную гомологию с фактором транскрипции Pax6 (рис. 5). N-концевая β-цепь, связывающая распознавание в одном из плеч транспозона с каталитическим центром на противоположной стороне и наоборот, является сингулярной особенностью shTnsB, однако еще предстоит определить, оказывает ли эта особенность некоторую аллостерическую регуляцию в каталитическом сайте DDE. . Две субъединицы shTnsB, участвующие в реакции, демонстрируют кислотную триаду в посткаталитическом состоянии. Атака 3′-ОН цепей транспозона на 5′ ДНК-мишени оставляет несвязанные основания (dT62 и dA63) в каждой цепи и молекулу воды, связанную с остатками аспарагиновой кислоты и остовом ДНК (дополнительная рис. 7) . На основании структуры концевого комплекса shTnsB-STC и концевого комплекса транспозона ecTnsB можно сделать вывод, что активный карман белков TnsB не приспособлен для катализа до связывания ДНК-мишени (рис. 4d). Скорее всего, этот механизм сочетается с транс-сборкой STC, чтобы предотвратить неспецифическое расщепление.

ShTnsB вставляет транспозон со смещением направленности ¹⁶ . Хотя концы LTR8-SR5 и LTR6-SR1 почти симметричны, длина и последовательности с правого и левого концов различаются (дополнительный рисунок 2f), что позволяет предположить, что эти различия в сочетании с необходимостью PAM для определения вставки сайте, может повлиять на направленность грузовой ДНК. Это мнение подтверждается наблюдением, что расстояние между PAM и местом прикрепления транспозона показывает очень узкое распределение ¹⁶ . Однако механизм, управляющий интеграцией ДНК-груза, до конца не ясен. Были предложены две альтернативные модели ^32,34 . В обоих случаях сборка филамента shTnsC будет работать как молекулярная линейка, направляющая shTnsB к месту прикрепления. Действительно, С-концевая область shTnsB взаимодействует с shTnsC ^32,34 , и взаимодействие shTnsB-shTnsC приводит к разборке филамента. Однако одна модель предполагает, что филамент shTnsC растет из shCas12k, а ассоциация головки филамента с shTniQ указывает на место вставки shTnsB и груз ДНК ³² . Вторая модель предполагает, что филамент shTnsC растет в противоположном направлении, и комплекс shCas12k-shTniQ останавливает рост, рекрутируя shTnsB с грузом ДНК, таким образом продолжая интеграцию ³⁴ . Обе модели ставят дополнительные вопросы относительно взаимодействия shTnsB-shTnsC. Как показано в структуре shTnsB-STC, не все протомеры имеют одинаковую конформацию, и неясно, все ли протомеры shTnsB, каталитически активные или неактивные протомеры, взаимодействуют с shTnsC (рис. 1d, e), поскольку в обоих случаях C -конец в структуре не визуализируется. Однако, по-видимому, он топологически доступен для дополнительных взаимодействий. В свете современных биохимических и структурных данных ^32,34 , мы хотели бы предложить альтернативную гипотетическую рабочую модель (рис. 8), которая считает, что shTnsC и shTnsB будут связаны до того, как shTnsC взаимодействует с ДНК, чтобы избежать неспецифических взаимодействий с геномом, которые могут быть токсичными для клетка. Таким образом, образование филаментов shTnsC будет динамичным, так как присутствие shTnsB вызовет диссоциацию сборки в отсутствие shCas12k и shTniQ. В этом сценарии ассоциация shCas12k с ДНК-мишенью и shTniQ стабилизирует сборку комплексов shTnsC-shTsnB в месте вставки, а затем запускает интеграцию груза ДНК. Необходим дальнейший анализ ассоциации shTnsB-shTnsC, чтобы полностью понять интеграцию ДНК-груза в CAST типа V-K и подтвердить любую из этих рабочих моделей.

ShTnsC связывается с ДНК, образуя филаменты, которые деполимеризуются с помощью shTnsB (слева). Учитывая взаимодействия shTnsC с shTnsB и shCas12k-shTniQ, возникают две возможности (штриховые квадраты). Во-первых, shTnsC, связанный с shTnsB, может рекрутироваться с помощью нацеливающего комплекса, включающего shCas12k и shTniQ (верхний пунктирный квадрат). Во-вторых, shTnsC может сначала связываться с нацеливающим комплексом, а затем рекрутировать shTnsB (нижний пунктирный квадрат). Обе возможности продуцируют комплекс перед транспозицией, активирующий активность интегразы shTnsB и приводящий к вставке транспозона.

Полноразмерное изображение

Отсутствие TnsA в типе V-K приводит к дополнительным вопросам относительно промежуточного разрешения интеграции, поскольку нерасщепленные 5′-концы транспозона приводят к продуктам коинтеграции транспозиции ^15,16 . Транспозоны, полагающиеся на транспозазы DDE, имеют разные механизмы для решения этой проблемы ^26,38,39 . Например, Tn5053 содержит резольвазу TniR, которая использует сайты res , также присутствующие в транспозоне, для разрешения коинтеграта 9.1259 40,41 , в то время как другие транспозазы генерируют шпильки для вырезания оставшейся ДНК ⁴² . Однако отсутствие домена вставки, который стабилизирует шпильку в каталитическом домене DDE shTnsB, не поддерживает эту возможность предотвращения коинтеграций. Кроме того, репликация ДНК и гомологичная рекомбинация могут разрешить коинтеграт в случае репликативной транспозиции ²⁶ .

С другой стороны, наличие специфичной для хозяина резольвазы подтверждается тем фактом, что при транспозиции в E. coli , 20% продуктов внедрения являются коинтегратами ¹⁶ . Действительно, набор генов системы V-K (TnsB, TnsC и TniQ) сходен с набором генов Tn5053, который содержит TniA, TniB (гомологи TnsB и TnsC) и TniQ ¹⁶ , и можно предположить, что резольваза не кодируется в Локус транспозона VK, но все еще присутствующий в естественном хозяине, может иметь ту же активность, что и резольваза TniR. Необходимо провести дальнейшие исследования на S. hofmannii или других родственных цианобактериях, прежде чем мы сможем полностью понять РНК-управляемую транспозицию в типе V-K. Решение этих вопросов является ключом к успешному созданию новых комплексов CAST, способных интегрировать большие ДНК-грузы в геномы эукариот.

Наша структура обеспечивает механистическое понимание того, как CAST shTnsB распознает последовательности ДНК RE и LE транспозона в STC. Структура также показывает конформационную гимнастику белка shTnsB для сборки с ДНК и дает подробное представление об активном центре после катализа. Полное выяснение механизмов сборки shTnsB с остальными компонентами CAST потребуется, чтобы использовать системы CAST для РНК-управляемой геномной инженерии.

Методы

Получение и очистка белков

Кодирующую последовательность (IDT) Scytonema hofmannii (UTEX 2349) tnsB (IDT) клонировали с C -концевой гексагистидиновой (His)-меткой в ​​вектор pET-21 (дополнительная таблица). Белки экспрессировали в клетках E. coli BL21 pRARE. Культуры E. coli выращивали при 37 °C в среде Terrific Broth (TB) с ампициллином в концентрации 100 мг/л до ОП ₆₀₀ , равной 0,6. Сверхэкспрессию белков индуцировали 250 мМ ИПТГ в течение 16–18 ч при 18°С. Клетки собирали центрифугированием, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Затем осадки ресуспендировали в лизирующем буфере (50 мМ HEPES pH 7,5, 500 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 9). 1331 2 , 1 мМ TCEP, 1 таблетка полного коктейля ингибиторов без ЭДТА (Roche) на 50   мл, 50 ЕД/мл бензоназы, 2   мг на 50   мл лизоцима). Ресуспендированные осадки перемешивали в течение 1 ч при 4°С. Лизис завершали обработкой ультразвуком, а лизат центрифугировали при 10 000 ×  г в течение 45 минут для разделения растворимой и нерастворимой фракций. Растворимую фракцию загружали в 5 мл колонку HisTrap FF Crude (Cytiva), уравновешенную в буфере IMAC-A (50 мМ HEPES, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 10 мМ имидазол, 1 таблетка полного коктейля ингибиторов, не содержащего ЭДТА ( Roche) на 500 мл), а связанные белки элюировали ступенчатым повышением концентрации имидазола буфером IMAC-B (50 мМ HEPES pH 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 500 мМ имидазол, 1 таблетка коктейля «Полный ингибитор»). без ЭДТА (Roche) на 500 мл). Обогащенные белковые фракции объединяли, а концентрацию NaCl снижали до 200 мМ с использованием буфера для разбавления (50 мМ HEPES, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Образец наносили на колонку HiTrap Heparin HP (GE Healthcare), уравновешенную буфером Heparin-A (50 мМ HEPES, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Белок элюировали линейным градиентом 0-100% буфера Heparin-B (50 мМ HEPES pH 7,5, 1 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Фракции, содержащие белок, объединяли и смешивали с TEV-протеазой для расщепления гистидиновой метки. Затем белок концентрировали и дополнительно очищали методом эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием колонки HiLoad 16/600 Superdex 200 (Cytiva), уравновешенной буфером SEC (50 мМ HEPES, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Фракции, содержащие чистый белок, объединяли, концентрировали до 9мг/мл, мгновенно замороженные в жидком азоте и хранящиеся при температуре -80 °C.

Производство ДНК

Последовательности ДНК, соответствующие отдельным повторам, двойным повторам и одноцепочечной одноцепочечной ДНК, были приобретены у IDT. Молекулы ДНК, содержащие три или более повторов, были получены с помощью ПЦР с донорной ДНК, клонированной в pUC57 (Genewiz) в качестве матрицы (дополнительная таблица 1). Последовательности ДНК были выбраны из природного транспозона для CAST типа V-K в S. hofmannii , описанном в ^4,7,21. Полную ДНК донора амплифицировали с использованием праймеров 5′-tgctacgtctctacgtgtacagtgactaat-3′ и 5′ ccacaaaaggcgtagtgtacagtgacaaat-3′, RE амплифицировали с использованием праймеров 5′-tgctacgtctctacgtgtacagtgactaat-3′ и 5′-atacaaaagcgacagtcaatttgtcattatgaaa -attatattgatgacatttaatttgtcatcaattaattaag-3′ и 5′-ccacaaaaggcgtagtgtacagtgacaaat-3′. Амплифицированные последовательности очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и элюировали водой, не содержащей нуклеаз.

Анализ сдвига электромобильности (EMSA)

ДНК (донорскую, RE, LE или LTR(6)-SR(1)) смешивали с shTnsB в буфере, содержащем 50 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ и 1 мМ TCEP. Концентрации ДНК и shTnsB указаны на дополнительных рисунках 3c – e. Образцы инкубировали при 37 °C в течение 30 мин и загружали в гели для замедления ДНК 6% (Thermo Fisher Scientific). ДНК выявляли окрашиванием геля GelRed (VWR). Затем тот же гель окрашивали InstantBlue (Life Technologies) для обнаружения присутствия shTnsB и сравнения сдвигов полос.

Крио-ЭМ пробоподготовка

Прекаталитический комплекс готовили с использованием 1 мкМ РЭ, 1 мкМ ЛЕ и 8 мкМ шТнсБ в 300 мкл буфера, содержащего 50 мМ HEPES рН 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl. ₂ и 1 мМ TCEP. Образец инкубировали в течение 30 мин при 37°С и концентрировали до 50 мкл в фильтрах 10 кДа. Восстановление STC показано на дополнительном рисунке 4 и проводилось следующим образом. Перенесенные и неперенесенные нити (TS и NTS) из RE (олигонуклеотиды RE_Target и RE_polyA в дополнительной таблице 1) и LE (олигонуклеотиды LE_Target и LE_polyA в дополнительной таблице 1) смешивали по отдельности, инкубировали при 95 °C в течение 5 мин и оставили на льду на 10 мин. Впоследствии комплементарная одноцепочечная ДНК-мишень была добавлена ​​к двухцепочечной ДНК TS-NTS из RE и LE (олигонуклеотиды Target_1 и Target_2 в дополнительной таблице 1 соответственно). ДцДНК TS-NTS из RE и LE инкубировали отдельно при 70 ° C в течение 5 минут и оставляли на льду на 10 минут. Затем их перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Наконец, 50 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ и 1 мМ TCEP добавляли к 10 мкМ ДНК STC ДНК перед добавлением 40 мкМ shTnsB. Образец инкубировали в течение 30 мин при 37°С.

Сетки для обоих образцов (прекаталитический комплекс и STC) были приготовлены путем нанесения 3  мкл свежеприготовленного комплекса (разведение 1:2) на сетки с отверстиями UltraAuFoil 300 меш R1,2/1,3 (Quantifoil), подвергнутые тлеющему разряду в течение 60 с при 10  мА (Leica EM ACE200) и замораживание погружением в жидкий этан (предварительно охлажденный жидким азотом) с использованием Vitrobot Mark IV (FEI, Thermo Fisher Scientific — время блоттинга 3 с, влажность 100%, 4 °C) .

Крио-ЭМ обработка данных

Сбор данных проводили с помощью EPU 2.12.1 (ThermoFisher). Обработку данных проводили с помощью программы cryoSPARC версии 3. 3.2 ²³ . Выполняли коррекцию движения заплаты и оценку CTF заплаты. Частицы 9646 K были первоначально отобраны из 4574 микрофотографий с использованием устройства для сбора капель с минимальным и максимальным диаметром 50 и 200 Å соответственно, а затем извлечены и отсортированы с помощью двух раундов 2D-классификации. Выбранные 2D-классы содержали 415 K частиц, извлеченных с использованием блока размером 416 × 416 пикселей. Трехмерная реконструкция ab initio использовалась в качестве начального объема для неравномерного уточнения, а полученные частицы были проанализированы с помощью трехмерного анализа изменчивости ⁴³ (дополнительный рисунок 5), который выявил непрерывную конформационную изменчивость дистальных концов ДНК и близлежащих доменов shTnsB (N-концевая часть и CTD цепей A и B). Два наиболее пространственно отличающихся полученных объема использовались в качестве эталонов для гетерогенного уточнения и были дополнительно уточнены с помощью неоднородного (NU) уточнения до глобального разрешения 2,47 Å (частицы 269 K) и 2,81 Å (частицы 155 K) на основе золотой стандарт корреляции оболочки Фурье (GSFSC) 0,143 критерий отсечки (дополнительный рисунок 6). Параметры расфокусировки для каждой частицы и параметры CTF для каждой группы были уточнены во время уточнения NU. При визуальном осмотре плотность карты 2,47 Å оказалась значительно более непрерывной. Эта карта была дополнительно улучшена на дистальных концах с помощью еще одной итерации трехмерного анализа изменчивости частиц ⁴³ и использование наиболее пространственно различных объемов в качестве эталонов для еще одного раунда неоднородного уточнения. Большинство частиц попали в один класс (208 K), который был окончательно уточнен с помощью уточнения NU до карты 2,46 Å. Анализ 3DFSC показал сферичность 0,928 и диапазон углового разрешения 2,4–3,1 Å (дополнительный рисунок 6). Анализ локального разрешения был выполнен с помощью MonoRes ⁴⁴ с использованием обертки cryoSPARC, который показал диапазон ~ 2–10  Å, при этом большая часть составляла около 2,5   Å, а дистальная часть — 4–8   Å. Построение модели выполнялось на картах, прошедших постобработку с помощью DeepEMhancer 0,13 ⁴⁵ . В качестве входных данных использовались полукарты, в то время как нормализация и маскирование/шумоподавление входных объемов выполнялись автоматически в режиме tightTarget, что давало карты со значительно улучшенной интерпретируемостью. Окончательная модель, построенная на картах DeepEMhancer, была окончательно проверена с использованием экспериментальных карт.

Построение и уточнение атомной модели

Исходная модель была создана на основе структуры MuA (PDB: 4FCY) с использованием автоматизированного сервера моделирования гомологии белковой структуры SWISS-MODEL 9.1259 46 . Это был жесткий корпус, встроенный в карту с помощью ChimeraX ⁴⁷ . Подгонка модели была проверена и дополнительно подогнана в COOT ⁴⁸ , а менее упорядоченные N- и C-концевые области были удалены. Модель Alphafold ⁴⁹ мономера shTnsB была впоследствии использована для включения некоторых из этих областей в карту. Далее модель была перестроена de novo в COOT и уточнена с использованием phenix. real_space_refine ⁵⁰ , в то время как сервер гибкой настройки Namdinator молекулярной динамики использовался для ускорения и улучшения модели для сопоставления соответствия и для уточнения модели как на ранней, так и на поздней стадии. этапы доработки ⁵¹ .

Анализ транспозиции и мутагенез in vivo

Активность транспозиции CAST определяли с использованием векторов pHelper, pTarget и pDonor, полученных от Addgene (кат. № 127922, 127926 и 127924). Мутанты shTnsB (рис. 7) были созданы в векторе pHelper с использованием набора для клонирования In-Fusion от Takara и праймеров, содержащих желаемые точечные мутации. Анализы in vivo проводили в соответствии с Saito et al. ⁵² . Вкратце, по 12 нг pHelper, pTarget и pDonor были преобразованы в 30 мкл TransforMax EC100 pir+ Electrocompetent 9.1267 E. coli (Люциген). Клетки восстанавливали в течение 1 ч и высевали на среду LB, содержащую ампициллин, канамицин и хлорамфеникол. Клетки соскребали через 24 часа после посева, лизировали в 15 мкл буфера для лизиса колоний (TE с 0,1% Triton X-100), кипятили в течение 5 минут, разбавляли 30 мкл воды и вращали при 4000×  г в течение 10 минут для осадка. обломки. Супернатант использовали для последующего анализа.

Анализ активности кПЦР

Частоту вставок относительно концентрации целевой плазмиды определяли с помощью кПЦР (TaqMan Fast Advanced Master Mix, Applied Biosytems) с набором праймеров/зонда (5′-6-FAM, Int ZEN и набор праймеров/зондов (5′-6-FAM, Int ZEN, 3′-Iowa Black, IDT), соответствующих продукту транспозиции (прямой праймер: 5′-ggttgagaagtcatttaataaggccactgttaaacg-3′, обратный праймер: 5′-aacgctgatgggtcacgacg- 3′, зонд: 5′-ctgtcgtcggtgacagattaatgtcattgtgac-3′) (рис. 7). Каждая реакция (11 мкл) содержала 2 мкл экстрагированных нуклеиновых кислот, 900 нМ прямого праймера, 900 нМ обратного праймера и 250 нМ зонда. Флуоресценцию измеряли с использованием прибора LightCycler 480 (Roche). Данные анализировали методом 2 ^–∆∆Ct с нормализацией по pTarget Ct.

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчета об исследовании природы, связанной с этой статьей.

Доступность данных

Реагенты, полученные в ходе этого исследования, предоставляются по запросу с заполненным Соглашением о передаче материалов. Атомные координаты и крио-ЭМ карты, включенные в это исследование, были депонированы в банке данных белков и банке данных электронной микроскопии под кодами доступа: PDB 8AA5, EMD-1529.4 и EMD-15344. Исходные данные qPCR и несрезанные гели предоставляются с этой статьей. Исходные данные приводятся вместе с настоящей статьей.

Список литературы

1. Макарова К.С. и др. Эволюционная классификация систем CRISPR-Cas: взрыв класса 2 и производные варианты. Нац. Преподобный Микробиолог. 18 , 67–83 (2020).

   Артикул КАС пабмед Google Scholar

2. Дудна, Дж. А. Перспективы и проблемы терапевтического редактирования генома. Природа 578 , 229–236 (2020).

   Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

3. Фор, Г. и др. CRISPR-Cas в мобильных генетических элементах: контрзащита и не только. Нац. Преподобный Микробиолог. 17 , 513–525 (2019).

   Артикул КАС пабмед Google Scholar

4. Петерс Дж. Э., Макарова К. С., Шмаков С., Кунин Е. В. Рекрутирование систем CRISPR-Cas Tn7-подобными транспозонами. Проц. Натл акад. науч. США 114 , E7358–E7366 (2017).

   Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

5. Кунин Е.В., Макарова К.С. Происхождение и эволюция систем CRISPR-Cas. Филос. Транс. Р. Соц. Лонд. Б биол. науч. 374 , 20180087 (2019).

   Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

6. «>

   Рыбарски Дж. Р., Ху К., Хилл А. М., Уилке К. О. и Финкельштейн И. Дж. Метагеномное открытие CRISPR-ассоциированных транспозонов. Проц. Натл акад. науч. США , https://doi.org/10.1073/pnas.2112279118 (2021).

7. Шмаков С. и др. Разнообразие и эволюция систем CRISPR-Cas класса 2. Нац. Преподобный Микробиолог. 15 , 169–182 (2017).

   Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

8. Klompe, S.E., Vo, PLH, Halpin-Healy, T.S. & Sternberg, S.H. Системы CRISPR-Cas, кодируемые транспозонами, обеспечивают прямую интеграцию ДНК под управлением РНК. Природа 571 , 219–225 (2019).

9. Hickman, A.B. et al. Неожиданное структурное разнообразие в рекомбинации ДНК: рестрикционная эндонуклеазная связь. Мол. Ячейка 5 , 1025–1034 (2000).

   Артикул КАС пабмед Google Scholar

10. «>

    Чой, К.Ю., Ли, Ю., Сарновский, Р. и Крейг, Н.Л. Прямое взаимодействие между субъединицами TnsA и TnsB контролирует гетеромерную транспозазу Tn7. Проц. Натл акад. науч. США 110 , E2038–E2045 (2013 г.).

11. Stellwagen, AE & Craig, NL. Анализ мутантов с усилением функции АТФ-зависимого регулятора транспозиции Tn7. Дж. Мол. биол. 305 , 633–642 (2001).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

12. Сарновский Р. Дж., Мэй Э. У. и Крейг Н. Л. Транспозаза Tn7 представляет собой гетеромерный комплекс, в котором активность разрыва и соединения ДНК распределяется между различными генными продуктами. EMBO J. 15 , 6348–6361 (1996).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

13. Питерс, Дж. Э. Tn7. Микробиолог. Спектр. 2 , 1–20 (2014).

14. Кудувалли, П. Н., Рао, Дж. Э. и Крейг, Н. Л. Структура ДНК-мишени играет решающую роль в транспозиции Tn7. EMBO J. 20 , 924–932 (2001).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

15. Райс, П. А., Крейг, Н. Л. и Дайда, Ф. Комментарий к «Вставка ДНК под управлением РНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами». Наука , https://doi.org/10.1126/science.abb2022 (2020).

16. Стрекер, Дж., Ладха, А., Макарова, К.С., Кунин, Е.В. и Чжан, Ф. Ответ на комментарий к «РНК-управляемая вставка ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами». Наука , https://doi.org/10.1126/science.abb2920 (2020).

17. Холдер, Дж. В. и Крейг, Н. Л. Архитектура посттранспозиционного комплекса Tn7: сложная нуклеопротеиновая структура. Дж. Мол. биол. 401 , 167–181 (2010).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

18. Kaczmarska, Z. et al. Структурная основа распознавания концов транспозонов объясняет центральные особенности систем транспозиции Tn7. Мол. Сотовый , https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.05.005 (2022).

19. Дэвис Д. Р., Горышин И. Ю., Резникофф В. С. и Реймент И. Трехмерная структура промежуточного продукта транспозиции синаптического комплекса Tn5. Наука 289 , 77–85 (2000).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед Google Scholar

20. Ghanim, G.E., Kellogg, E.H., Nogales, E. & Rio, D.C. Структура комплекса транспозаза-ДНК P-элемента выявляет необычные структуры ДНК и контакты GTP-ДНК. Нац. Структура Мол. биол. 26 , 1013–1022 (2019).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

21. «>

    Strecker, J. et al. Вставка ДНК под управлением РНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами. Наука 364 , 48–53 (2019).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

22. Montaño, S.P., Pigli, Y.Z. & Rice, P.A. Структура транспозосом μ проливает свет на эволюцию рекомбиназы DDE. Природа 491 , 413–417 (2012).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

23. Пуджани, А., Рубинштейн, Дж. Л., Флит, Д. Дж. и Брубейкер, М. А. cryoSPARC: алгоритмы для быстрого неконтролируемого определения структуры крио-ЭМ. Нац. Методы 14 , 290–296 (2017).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

24. Маннервик, М. Гены-мишени гомеодоменовых белков. Bioessays 21 , 267–270 (1999).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

25. Хикман, А. Б. и Дайда, Ф. Механизмы транспозиции ДНК. Микробиологический спектр. 3 , 0034–2014 (2015). МДНА3-.

    Артикул Google Scholar

26. Siguier, P., Gourbeyre, E. & Chandler, M. Известные известные, известные неизвестные и неизвестные неизвестные в прокариотической транспозиции. Курс. мнение микробиол. 38 , 171–180 (2017).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

27. Allingham, J.S., Pribil, P.A. & Haniford, D.B. Все три остатка каталитической триады транспозазы Tn 10 DDE функционируют в связывании ионов двухвалентных металлов. Дж. Мол. биол. 289 , 1195–1206 (1999).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

28. «>

    Peterson, G. & Reznikoff, W. Мутации активного сайта транспозазы Tn5 указывают на положение донорской основной ДНК в синаптическом комплексе. J. Biol. хим. 278 , 1904–1909 (2003).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

29. Холм, Л. и Лааксо, Л. М. Обновление сервера Дали. Рез. нуклеиновых кислот . 44 , W351–W355 (2016).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

30. Xu, H. E. et al. Кристаллическая структура комплекса парный домен Pax6 человека и ДНК показывает специфическую роль линкерной области и карбоксиконцевого субдомена в связывании ДНК. Гены Дев. 13 , 1263–1275 (1999).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

31. Benler, S. et al. Гены-карго Tn7-подобных транспозонов включают огромное разнообразие защитных систем, мобильных генетических элементов и генов устойчивости к антибиотикам. mBio 12 , e0293821 (2021).

    Артикул пабмед Google Scholar

32. Querques, I., Schmitz, M., Oberli, S., Chanez, C. & Jinek, M. Выбор и ремоделирование целевых участков с помощью систем CRISPR-транспозонов типа V. Природа 599 , 497–502 (2021).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

33. Xiao, R. et al. Структурные основы распознавания ДНК-мишени с помощью CRISPR-Cas12k для РНК-управляемой транспозиции ДНК. Мол. Сотовый 81 , 4457–4466.e4455 (2021).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

34. «>

    Park, J. U. et al. Структурная основа для выбора сайта-мишени в системах транспозиции ДНК, управляемых РНК. Наука 373 , 768–774 (2021).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

35. Халпин-Хили, Т.С., Кломпе, С.Е., Штернберг, С.Х. и Фернандес, И.С. Структурная основа нацеливания ДНК с помощью системы CRISPR-Cas, кодируемой транспозонами. Природа 577 , 271–274 (2020).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед Google Scholar

36. Jia, N., Xie, W., de la Cruz, M.J., Eng, E.T. и Patel, D.J. Структурно-функциональное понимание начального этапа интеграции ДНК с помощью комплекса CRISPR-Cas-Transposon. Сотовый рез. 30 , 182–184 (2020).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

37. «>

    Skelding, Z., Queen-Baker, J. & Craig, N.L. Альтернативные взаимодействия между транспозазой Tn7 и белком, связывающим ДНК-мишень Tn7, регулируют иммунитет и транспозицию мишени. EMBO J. 22 , 5904–5917 (2003).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

38. Холодий Г.Ю. и др. Четыре гена, два конца и res-область участвуют в транспозиции Tn5053: парадигма нового семейства транспозонов, несущих либо мероперон, либо интегрон. мол. микробиол. 17 , 1189 (1995).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

39. Николас Э. и др. Семейство репликативных транспозонов Tn3. Микробиолог. Спектр. 3 , 0060–2014 (2014). МДНК3.

    Google Scholar

40. Петровский С. и Станисич В. А. Tn502 и Tn512 являются охотниками за res-сайтами, что свидетельствует о независимой от резольвазы транспозиции в случайные сайты. Дж. Бактериол. 192 , 1865–1874 (2010).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

41. Минахина С., Холодий Г., Миндлин С., Юрьева О., Никифоров В. Транспозоны семейства Tn5053 являются охотниками за рез-сайтами, распознающими плазмидные рез-сайты, занятые родственными резольвазами. Мол. микробиол. 33 , 1059 (1999).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

42. Chen, Q. et al. Структурная основа бесшовного вырезания и специфического нацеливания транспозазой piggyBac. Нац. коммун. 11 , 3446 (2020).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

43. Пунджани, А. и Флит, Д. Дж. Трехмерный анализ изменчивости: выявление непрерывной гибкости и дискретной неоднородности крио-ЭМ с одной частицей. Дж. Структура. биол. 213 , 107702 (2021).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

44. Вилас, Дж. Л. и др. MonoRes: автоматическая и точная оценка локального разрешения для карт электронной микроскопии. Структура 26 , 337–344.e334 (2018).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

45. Санчес-Гарсия, Р. и др. DeepEMhancer: решение для глубокого обучения для крио-ЭМ объемной постобработки. Комм. биол. 4 , 874 (2021).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

46. Bienert, S. et al. Репозиторий SWISS-MODEL — новые возможности и функциональность. Рез. нуклеиновых кислот. 45 , Д313–д319 (2017).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

47. «>

    Goddard, T.D. et al. UCSF ChimeraX: решение современных задач визуализации и анализа. Науки о белках. 27 , 14–25 (2018).

    Артикул КАС пабмед Google Scholar

48. Эмсли П., Локамп Б., Скотт В. Г. и Коутан К. Особенности и развитие Coot. Acta Кристаллогр. Д. биол. Кристаллогр. 66 , 486–501 (2010).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

49. Бэк, М. и др. Точное предсказание белковых структур и взаимодействий с использованием трехдорожечной нейронной сети. Наука 373 , 871–876 (2021).

    Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

50. Адамс, П. Д. и др. PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярной структуры. Acta Кристаллогр. Д. биол. Кристаллогр. 66 , 213–221 (2010).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

51. Kidmose, R. T. et al. Namdinator — автоматическая молекулярно-динамическая гибкая подгонка структурных моделей к крио-ЭМ и кристаллографическим экспериментальным картам. IUCrJ 6 , 526–531 (2019).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

52. Сайто, М. и др. Двойной режим CRISPR-ассоциированного самонаведения транспозонов. Cell 184 , 2441–2453.e2418 (2021).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

Загрузить ссылки

Благодарности

Мы благодарим Датский национальный центр крио-ЭМ в CFIM Копенгагенского университета и особенно Тиллманн Пейп за поддержку во время сбора крио-ЭМ данных. Мы также благодарим отдел экспрессии белков CPR за помощь в экспрессии и очистке белков. ФТК является участником Копенгагенской программы докторантуры по биологическим наукам (NNF19SA0035440). Г.М. является частью Центра белковых исследований (CPR) Фонда Ново Нордиск, который финансируется Фондом Ново Нордиск (грант NNF14CC0001). Эта работа также была поддержана грантом NNF0024386, грантом NNF17SA0030214 и грантами Distinguished Investigator (NNF18OC0055061) для GM, который является членом Кластера интегративной структурной биологии (ISBUC) в Копенгагенском университете.

Информация об авторе

Примечания автора

1. Стефано Стелла

   Текущий адрес: Twelve Bio ApS, Ole Maaløes Vej 3, 2200, Копенгаген, Дания

Авторы и филиалы

1. Группа структурной молекулярной биологии, Фонд Ново Нордиск, Центр белковых исследований, Университет здравоохранения и наук of Copenhagen, 2200, Копенгаген, Дания

   Франциско Тенхо-Кастаньо, Николас Софос, Луиза С. Штуцке, Андерс Фульсанг, Стефано Стелла и Гильермо Монтойя

2. Отделение по очистке и характеристике белков, Исследовательский центр Ново Нордиск, Факультет Копенгагенского университета здоровья и медицинских наук, 2200, Копенгаген, Дания

   Blanca López-Méndez

Авторы

1. Francisco Tenjo-Castaño

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

2. Николас Софос

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

3. Blanca López-Méndez

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

4. Luisa S. Stutzke

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

5. Anders Fuglsang

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

6. Stefano Stella

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

7. Гильермо Монтойя

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

Contributions

G. M. задумал исследование, F.T.C. и Г.М. поставил биохимические эксперименты. ФТК и С.С. установили протокол экспрессии и очистки. ФТК и AF охарактеризовали свойства связывания белок-ДНК. ФТК и Л.С. создали мутантов и провели эксперименты по транспозиции. ФТК и Б.Л.М. выполнил анализ SEC-MALS, F.T.C. подготовили сетки ЭМ и собрали крио-ЭМ изображения с Н.С. ФТК и Н.С. выполнил крио-ЭМ обработку данных, построил модели и Г.М. приступил к крио-ЭМ карте и анализу структуры с их помощью. Общие результаты обсуждались и оценивались со всеми авторами. Г.М. координировал и руководил проектом и написал рукопись с участием всех авторов.

Автор, ответственный за переписку

Переписка с Гильермо Монтойя.

Декларации этики

Конкурирующие интересы

Г.М. и S.S. являются соучредителями и членами Twelve Bio BoD. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Рецензирование

Информация о рецензировании

Nature Communications благодарит анонимных рецензентов за их вклад в рецензирование этой работы. Доступны отчеты рецензентов.

Дополнительная информация

Примечание издателя Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Дополнительная информация

Дополнительная информация

Файл рецензирования

Описание дополнительных дополнительных файлов

Дополнительный фильм 1

.0005

Исходные данные

Исходные данные

Права и разрешения

Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате. , при условии, что вы укажете первоначальных авторов и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке материала. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или превышает разрешенное использование, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Перепечатки и разрешения

Об этой статье

VK 45.02 A — Немецкий тяжёлый танк VIII уровня

Blitz Ангар

База танков и советы по World of Tanks Blitz

Стоимость

• 2 435 000
• 90 000

Предшественник

• VIIТигр (P)

Преемник

• IXВК 45. 02 Б

Конкурирует с

• VIIIТигр II
• VIIIВК 100.01 (П)

Конфигурация

Провизия

Оборудование

Модули

Навыки экипажа

Расходные материалы

• 90-е годы

• 90-е годы

• 90-е годы

• 75 с
  15 с

• 90-е годы

• 75 с
  15 с

• 90-е годы
  20-е годы

Бустеры

Параметры

Сравните параметры танка с другими из:

1750

HP

30 / 45

282,5 м

Дальность обзора

2 / 45

Огневая мощь

2270

ДПМ

15 / 45

215

Penetration

37 / 45

310

Damage

26 / 45

150

Devices/crew damage

22 / 45

—

Burst damage

950

Velocity

28 / 45

9,30%

Потеря проникновения на расстоянии

14 /45

—

Радиус взрыва

1904

DPM

15 /44

265

ПЕРЕДЕЛЕНИЕ

. 0006 19 /44

260

повреждение

26 /44

150

Устройства / урон экипажа

21 /44

—

. %

Потеря проникновения на расстоянии

12 /28

—

Радиус взрыва

3076

DPM

9 /44

60

. Проникновение

18 /44

42059

.0005

повреждение

23 /44

150

Устройства / повреждение экипажа

21 /44

—

Повреждение.

1,91

Радиус взрыва

22 /44

Проникновение

Повреждение

Устройства / ущерб экипажу

Потерян.0005

Explosion radius

105.0

Caliber

24 / 45

7.32

Rate of fire

14 / 45

8.19

Reload time

10 / 36

—

Magazine reload time

Время заряжания следующего снаряда

—×

Размер магазина

—

Время до готовности следующего снаряда

Обращение с оружием

2,08

Базовое время сведения

8 / 45

0. 335

Dispersion

15 / 45

Dispersion factors

0.160

When moving

3 / 45

0.160

When rotating

4 / 45

0.100

При вращении башни

2 /45

3.000

после выстрела

1 /45

Углы оружия

6 °

Депрессия

31 /45

17 °

Элевация

31 /45

17 °

660005

26/45

180 ° / 180 °

Арма (слева / справа)

1 /45

29,16

Трорачная скорость

15 /45

Мобильность

565

969995

9

9

9

9

9

9

9

99965

9

9

5

69

969

9

95

999999

9999999999999999999959

9

26 / 45

38

Вперед

20 / 45

16

Назад

10 / 45

Эффективная мощность/масса

14,76

На пересеченной местности

7 / 45

12. 49

On medium terrain

4 / 45

6.49

On soft terrain

34 / 45

Traverse speed

44.82

On hard terrain

1 / 45

37,93

на средней местности

1 /45

19,72

на мягкой местности

13 /45

6,66 м × 3,12 м..23%

, в то время как все еще

34 /45

5,62%

при перемещении

33 /45

3,51%

при стрельбе, пока

35 /45

2,76%

6.

35 / 45

Дистанция обнаружения противником с дальностью обзора 271 м

250,6 м

На месте

258,6 м

На ходу

263,2 м

При стрельбе на месте

264,9 м

При стрельбе в движении

Основная броня

• 240–300

• 180–240

• 120–180

• 60–120

• 0–60

Разнесенная броня

• 288–360

• 216–288

• 144–216

• 72–144

• 0–72

Голова

Сбоку

Сзади

Инициализация…

Пик-а-бу Средний

• Рассеивание хороший
• Дисперсия в движении хороший
• Соотношение мощность/вес средний
• Скорость назад хороший
• Прицельная дуга хороший

Средний

• Рассеивание хороший
• Дисперсия в движении хороший
• Соотношение мощность/вес средний
• Скорость назад хороший
• Прицельная дуга хороший

Вы прячетесь за укрытием, полностью перезаряжаете свое оружие, предварительно прицеливаетесь и ускользаете за секунду сделать один поражающий выстрел. Прежде чем враг поймет, что вы снова спрятался. Достойная подвижность и стабилизация прицеливания и вы конечно может осуществить это один.

Снайперская стрельба на дальние дистанции Средний

• Рассеивание средний
• Скорость снаряда хороший
• Повреждать хороший
• Проникновение хороший

Средний

• Рассеивание средний
• Скорость снаряда хороший
• Повреждать средний
• Проникновение средний

Прятаться в кустах на холме и стрелять по врагам с другой стороны карты. Если вы не возражаете против всей ненависти, которая приходит с этим, тогда вы просто нужно хорошее рассеивание и пробитие, чтобы каждый выстрел был засчитан.

Линия фронта Не рекомендуется

• Передняя броня плохой

Не рекомендуется

• Передняя броня плохой

Забудьте о скалах, холмах, зданиях и прочем укрытии. Сделай себя прикрытие для ваших товарищей по команде. Конечно, это работает, только если у вас очень хорошую броню и уметь ею пользоваться или… ну если ты уже мертв.

Круг смерти Не рекомендуется

• Прицельная дуга хороший
• Скорость перемещения плохой
• Соотношение мощность/вес средний

Не рекомендуется

• Прицельная дуга хороший
• Скорость перемещения плохой
• Соотношение мощность/вес средний

Двигайтесь за медленными истребителями танков и тяжелыми танками и продолжайте кружить вокруг них, чтобы избежать удара, делая легкие выстрелы в спину врага. Требуется хорошая скорость перемещения и ускорение.

Ударь и беги Не рекомендуется

• Диапазон просмотра хороший
• Скорость вперед плохой
• Соотношение мощность/вес плохой

Не рекомендуется

• Диапазон просмотра средний
• Скорость вперед плохой
• Соотношение мощность/вес плохой

Спрячьтесь в кустах, незаметно заметьте врага. Сделайте снимок и начать бежать. Быстрый. Повторяйте, пока не останется врагов. Овладейте этой техникой и на вашем пути будет много мастерства.

драка 1 на 1 Не рекомендуется

• ДПМ плохой

Не рекомендуется

• ДПМ плохой

Кто победит в драке 1 на 1, зависит от слишком многих переменных. Броня, оружие, подвижность, размеры танков и многое другое. Одно точно: без добра DPM: лучше оставаться в группе или держаться на расстоянии.

Историческая справка

Разработка этой машины началась в апреле 1942 года. Фирма «Крупп» получила заказ на постройку башни. Однако прототип так и не был изготовлен. Башни устанавливались на первые Tiger II.

Reddit — Погрузитесь во что угодно

О чем все это?
В последнее время я заметил несколько случаев, когда утверждалось, что VK-00 является самым быстрым квантовым приводом (QD) размера 1 без особого объяснения, почему. Это включает в себя обсуждения здесь, на Reddit, а также видео создателей контента на Youtube.
Я хотел бы воспользоваться этой возможностью, чтобы показать, почему это утверждение в целом чрезмерно упрощено, с одной стороны, и по большей части ошибочно, с другой.

источник: https://starcitizen.tools/VK-00

[ TLDR]
Параметр «скорость» квантового привода часто неправильно интерпретируется. Правильное значение — максимальная скорость, а не фактическая скорость, на которую также сильно влияют значения ускорения. Вместо этого используйте стелс-драйв, если хотите как можно быстрее преодолевать короткие и средние расстояния.

Как получилось?
У меня есть сильное подозрение относительно того, как возникает это предположение. Поскольку игра не предоставляет никакой статистики по внутриигровому QD или любому другому компоненту в этом отношении, люди по понятным причинам обращаются к партийным веб-сайтам 3 ^rd , таким как Erkul, с намерением принять более взвешенное решение о том, какие компоненты получить. К сожалению, с QD это не так просто, как прямое сравнение параметров. Но это именно то, что, скорее всего, произойдет. Сортировка дисков S1 по «скорости» и ВК-00 оказывается на первом месте…

Модель под капотом
Обозначение этого параметра немного неудачное. Максимальная скорость (vmax) была бы более подходящей. Это максимальная скорость, которую может развить привод. Однако это значение не достигается мгновенно. Сначала привод проходит фазу ускорения. Как видно ниже, скорость, с которой привод разгоняется, не является постоянной, а представляет собой линейную функцию с начальным (a1) и конечным (a2) значениями. Эркул называет их ускорением стадии 1 и стадии 2. Следовательно, это приводит к квадратичному приращению скорости до тех пор, пока привод не достигнет своего значения vmax. Прежде чем достичь места назначения, привод проходит фазу торможения, которая следует тем же правилам.

Вот график, иллюстрирующий это: (переход CRU->HUR)

Рис. 1: Кривые ускорения, скорости и расстояния при переходе CRU->HUR

Итак, что все это значит?
Это означает, что время, необходимое КТ для прохождения определенного расстояния, определяется тремя параметрами, а не только одним. Это также означает, что, поскольку функция зависимости расстояния от времени прохождения не линейная и не квадратичная, а кубическая (!) в принципе невозможно достоверно судить о производительности КТ, глядя на параметры на глаз или только сортируя. Время в пути должно быть рассчитано для каждого интересующего расстояния, поскольку чаще всего водитель может быть быстрее на более короткие расстояния по сравнению с конкурентом, но медленнее на более длинные расстояния или наоборот.

VK-00 против конкурентов
Итак, давайте посмотрим, как VK-00 работает против популярного привода Atlas и невидимого привода Spectre на примере прыжка на 1 км.

Drive	a1 [km/s 2]	a2 [km/s 2]	vmax [km/s]
VK-00	625	3’724	283’046
Spectre	1’035	3’426	201’112
ATLAS	735	2’433	151’951

Fig. 2: VK-00. VS ATLA и Specster, 1 MK. ускоряется быстрее, чем VK-00 в любой момент времени, и, поскольку это всего лишь короткий скачок, ни один из приводов даже близко не приближается к своему vmax. Так что VK-00 не может играть на своей кажущейся силе, у него высокий vmax. Забавно, но привод с самой высокой пиковой скоростью в этом сценарии — это Spectre. При таких обстоятельствах неудивительно, что он совершает прыжок примерно на 10 секунд быстрее, чем VK-00.
Даже Atlas, с намного более низкими a2 и vmax, по-прежнему совершает прыжок примерно на 2 секунды раньше, чем VK-00.

Таблицы поиска времени в пути
Итак, как это работает для различных расстояний? Ниже приведены три диаграммы лучших дисков S1 (мой личный выбор). Они отображают расстояние в зависимости от времени в пути, разделенные на графики в масштабе ближнего, среднего и дальнего действия для лучшей читаемости.

Рис. 3: Время в пути в зависимости от расстояния, подборка лучших дисков S1

Глядя на эти графики, основное утверждение можно определенно опровергнуть по большей части.
VK-00 на самом деле является самым медленным приводом в группе до 3 Мкм, после чего он начинает опережать второй самый медленный в линейке Atlas.
На последнем графике хорошо видно, что высокое значение vmax, которое часто считают отличительной чертой VK-00, начинает значительно сокращать время в пути только при более длинных прыжках. Однако высокий расход топлива сразу компенсирует это для большинства небольших кораблей с их ограниченными топливными баками. Они иссякают до того, как преимущество действительно начинает проявляться.
Тем не менее, есть несколько кораблей с большими топливными баками, таких как Eclipse или Defender, которые могут довести его до точки, где VK-00 действительно станет самым быстрым S1 QD. Точка разрыва, где он превосходит Spectre, находится прибл. 37 кмкм, после сжигания 797 л Qt топлива:

расстояние зависит от трех параметров. Не только один.