Вк таргет что такое: пошаговая инструкция, как запустить и настроить рекламу | Дропшиппинг

Содержание

Чем отличается таргетированная реклама ВКонтакте от аналогичной в Фейсбуке? — Маркетинг на vc.ru

Санкции, ограничения, блокировки. В новой реальности вести рекламные кампании через кабинет ФБ стало практически нереально, отпал привычный многим рабочий инструмент. Что пришло на смену? Верно — давно забытый многими Вконтакте, в котором тоже есть возможность настраивать рекламу.Чем же отличаются эти 2 соцсети, и можно ли просто перенести рекламу из кабинета на одной платформе в другой, без потери эффективности и результатов? Давайте разбираться:1. Рекламные алгоритмы ФБ и Вконтакте отличаются друг от друга и отрицать это не будет ни один таргетолог.

1331 просмотров

Например, для того, чтобы понять, «зашло ли» объявление в Инстаграм, нужно подождать некоторое время, и зачастую это пару дней — потому что оптимизация и прочее «волшебство» ФБ постепенно находит нужную аудиторию, и ему на это требуется время. Во Вконтакте же все проще: при должном бюджете уже через пару часов станет ясно — сработало или нет.

Различие есть и в настройке аудиторий. Чаще всего, самые лучшие результаты в рекламном кабинете ФБ показывает широкая аудитория (ограниченная только ГЕО и полом/возрастом, без интересов), во Вконтакте такое «не прокатит». Чем уже и точнее ЦА — тем лучше. Безусловно, все спорно, но последние тесты показали, что запуски во многих нишах «на широкую» имеют, откровенно говоря, плохие результаты.

Сравнение таргетированной рекламы во Вконтакте и на Фейсбуке

2. Значительные различия в креативах, которые «работают»

Вернемся к вопросу «А можно ли просто перенести баннеры из инсты в вк? Сработает?». Сработает, но далеко не всегда. В Инстаграм мы привыкли видеть красивую картинку, эстетику и уютную атмосферу. Это визуальная социальная сеть, где, если ты не имеешь «продающего визуала», продавать будет трудно. Если картинка не зацепит сразу — в текст никто не и посмотрит. Там дизайн ценится очень и очень высоко.

Но, стоит отметить, что в последнее время и в таргете в Инстаграм не всегда заходили лучше сложные дизайнерские решения.

Во многих проектах, простые баннеры, собранные во внутреннем редакторе для сторис показывали наилучшие результаты. Причин этому несколько: пробитие баннерной слепоты (легкая небрежность выделяется на фоне идеально «вылизанных» картинок) и доверие к простоте(работает по такому принципу: то, что проще — ближе к народу, к людям, поэтому по нему кликнут). Конечно, за все ниши говорить не буду, но для оффлайн-бизнеса такой подход работал на ура!

Во Вконтакте же изображения несут более дополняющий характер — они либо развивают текст, либо доказывают, подтверждают его. Тут люди читают, и читают много: лонгриды, сторителлинги, истории. ВСЕ!

Картинка, которая выглядит как реальная фотография вызовет больше доверия, на пост захочется нажать, перейти, почитать еще. Представим ситуацию: читает рядовой пользователь историю якобы одной девушки, которая прошла курс по дизайну и кардинально изменила свою жизнь. За 10 000 символов он уже расположился к ней душой, сопереживает, ему интересно, чем все кончится.

В конце она говорит, мол, училась я вот тут, и вот мои работы. И вместо работ начинающего дизайнера там прикреплена картинка-шедевр явно опытного специалиста (люди не дурачки, они точно раскусят, поверьте), так еще и жирным красным шрифтом написано: «скидка -50% только сегодня». Скорее всего, эта ситуация вызовет негативную реакцию, и человек просто пролистает дальше. И правильно сделает! Ведь чтобы «дожать» нужно было всего на всего показать работы начинающего дизайнера, а мы попытались втюхать — вот все и оборвалось..

Реальные фотографии реальных людей

Поэтому запомните важное правило:

Сложный дизайн рекламных объявлений ВК делаем только в том случае, если есть четкий брендинг. Если же нам нужны доверие, лиды и продажи — используем повседневные фотографии и картинки, максимально приближенные к реальности!

Сам собой появляется ответ на вопрос: «Можно ли перенести рекламные баннеры из Инсты в Вк и ничего не потерять в показателях?». Зависит от материалов, конечно же, но, скорее всего, нет. Еще и потому, что в Инсте упор идет на сторис (удобнейший инструмент продаж!), а ВК он попросту не развит. Да, сейчас это будет постепенно меняться, однако, на это требуется время, и первые тесты показали то, что сторис не так эффективны в сравнении с другими форматами рекламы.

Если дизайн, то максимально простой. Текст на картинке дополняет содержание рекламного объявления.

3. В ВК нужно действительно хорошо понимать свою аудиторию, от балды запустить не получится.

И для этого тут есть все инструменты. В Инстаграм тоже полезно было знать «в лицо» тех, кому продавали, но за счет того, что широкие аудитории хорошо работали, многие «инста-маркетологи» не лезли в такие дебри. Их понимание ЦА оканчивалось на описании «молоденькие девушки, лет 18-25, которые хотят изменить свою жизнь к лучшему, живут по всей РФ, ходят с айфонами, и раз так, то у них точно есть деньги купить наш курс». И как бы это грустно не звучало, такое могло прокатить, ведь умные алгоритмы сами подбирали все, что нужно.

В Вк для поиска ЦА используется огромное количество настроек, и с длительностью ведения рекламной кампании увеличивается сложность удержания показателей на одном уровне. Базы выгорают, их нужно вручную собирать и загружать, тестировать креативы, в общем — экспериментировать. И экспериментировать вручную — тут никто за тебя это делать не будет.

Таргет Вконтакте — это огромное количество кропотливой, скурпулезной ручной работы.

4. А еще, в отличие от Инстаграм, тут есть парсеры!

Это специальные приложения, собирающие пользователей, которые соответствуют конкретному условию. Показывать рекламу такой аудитории в Инстаграм раньше было гораздо дороже, чем «на широкую» и менее эффективно, а вот в ВК все наоборот. Чем точнее собрана база людей — тем лучше сработает реклама. Более того, возможность показывать рекламу подписчикам конкретных сообществ во Вконтакте есть внутри самого рекламного кабинета! То есть, все алгоритмы сразу заточены под такой подход работы с аудиториями.

Интерфейс одного из самых популярных парсеров для ВК — Таргет Хантера

5. В Вк можно настроить показ объявления по ключевым фразам, прям как в контекстной рекламе. В кабинете ФБ такого и подавно не было 🙂

Очень удобный способ найти людей, которые интересовались нужной тематикой за последние 3-5-10-сколько нужно дней. По результатам тестов стало понятно, что этот способ нахождения целевой аудитории отлично работает и более того, приводит максимально вовлеченных людей!

Какие выводы можно сделать? Пожалуй, только один: реклама ВК ≠ реклама в Инстаграм. Разные принципы работы, разные алгоритмы, разная специфика и разное поведение аудитории. Перенести рекламу с одной платформы на другую полностью не получится — адаптировать будет необходимо в любом случае, иначе, эффективность рекламы значительно снизится.

понятие и принцип работы, советы по настройке таргетированной рекламы для заработка в социальной сети

Главная » Продвижение вк

Продвижение вк

Автор Евгения А.

На чтение 3 мин Просмотров 264

Социальными сетями пользуется большая часть населения, поэтому «ВК Таргет» считается одним из самых эффективных средств продвижения товара или услуги. С помощью этого инструмента можно выбирать, кому стоит показывать объявления. Это исключает лишнюю трату средств, делает рекламу более продуктивной.

«ВК Таргет» считается самым эффективным средством продвижения товара.

Содержание

Понятие таргетинга во «ВКонтакте»
Принцип работы
Преимущества
Как настроить таргетированную рекламу в социальной сети
Сервисы для повышения эффективности
Анализ таргета
Обзор

Понятие таргетинга во «ВКонтакте»

Так называется способ продвижения товара или услуги в социальных сетях. Реклама отображается только на страницах заинтересованных людей.

Этим таргетинг отличается от постов, размещаемых по договоренности с администратором.

Применяется 2 способа демонстрации объявлений:

Текстово-графический. Рекламные блоки появляются при переходе в любой раздел соцсети. При нажатии на заголовок или картинку система перебрасывает пользователя на сайт. Этот формат слегка устарел, однако стоимость размещения минимальна. Выключить блок можно с помощью надстроек-блокировщиков для браузера.
Проморазмещение. Реклама встраивается в ленту новостей, показывается среди постов в пабликах. Она выглядит как стандартные записи. Однако есть отличие – пометка «Рекламная запись».

Принцип работы

Соцсети постоянно собирают пользовательские данные: просмотренные фото, поставленные отметки. Это помогает сортировать аудиторию по интересам. При использовании «ВК Таргета» продвижение осуществляется через ключевые запросы. С помощью стоп-слов заказчик ограничивает показ объявлений людям, не считающимся представителями целевой аудитории. Инструмент отображает информацию о товарах и услугах у пользователей, интересующихся похожими. При вводе ключевых запросов система предлагает часто применяемые синонимы.

Показ рекламы ограничивается с помощью стоп-слов.

Преимущества

Главным достоинством считается повышенная эффективность при минимальных расходах.

Информация показывается только заинтересованным пользователям. Количество размещений, в сравнении с классической рекламой, снижается.

Как настроить таргетированную рекламу в социальной сети

После входа в рекламный кабинет нужно правильно задать следующие параметры:

Местоположение клиентов. Многие пользователи указывают город проживания. Информация может браться и с устройств, фиксирующих геолокацию.
Демографию пользователей. Рекламный инструмент извлекает данные из профилей. Информация при этом может быть скрытой. Учитываются возраст и пол, с помощью которых формируется примерный портрет потенциального покупателя. Сплит-тестирование активируют при большой аудитории.

Интересы. Здесь выбирают группу предпочтений: транспорт, путешествия, работу, одежду и обувь. Эти пункты интересны большинству пользователей «ВКонтакте», поэтому применяются для настройки рекламы.
Образование и работу. Через этот раздел можно настроить показ объявлений лицам той или иной специальности. Например, студенту пригодятся сайты для дополнительного заработка, маркетологу – курсы повышения квалификации.
Участников групп. При активации этой функции рекламные блоки будут показываться лицам, состоящим в тематических сообществах.
Параметры браузеров и устройств. Рекламу можно демонстрировать только владельцам ПК, смартфонов с ОС «Андроид» или «Айфон». Доступна более тонкая настройка параметра.

Сайты и приложения. Здесь вводят название сервиса, в котором должны авторизоваться представители ЦА.
Время показа. Рекламу можно демонстрировать в заданные периоды. Это снижает количество нецелевых показов, экономит деньги.

После входа в кабинет нужно настроить параметры рекламы.

Сервисы для повышения эффективности

Лучшими считаются «Церебро», «ТаргетХантер», Allsocial, Borgi. Сервисы управляют рекламным кабинетом, ищут целевую и похожую аудиторию.

Другими функциями являются:

обнаружение активных пользователей;
оповещение клиентов, читающих отдельные посты;
поиск нужных пабликов.

Анализ таргета

Самым распространенным средством считается плагин Pepper.Panel. Инструмент встраивается в браузер, определяет, какие объявления привлекают клиентов и расходуют меньше денег. При первых размещениях анализ выполняют вручную.

Обзор

Использование контекстного таргетинга ВК на примере работы с автодилерскими центрами от Бородатого маркетинга

Функция контекстного таргетинга появилась ВКонтакте меньше года назад, но уже стала одной из самых эффективных, хотя многие специалисты не до конца понимают функционал и возможности этих настроек. Здесь мы подробно разберем, что можно с ними делать, и что из этого можно получить.

Как работает контекстный таргетинг ВКонтакте

Контекстный таргетинг ВКонтакте обозначен контекстной рекламой в Яндексе и на других ресурсах, связанных с контекстом. Это значит, что вы будете работать с аудиторией, у которой уже сформирован спрос. Если берёте ключевые фразы для горячей аудитории, ищущей в данный момент ту услугу или товар, которые вы предлагаете, то получите максимально мотивированных пользователей. Для социальной сети это большой плюс, потому что в среднем в соцсетях приходится работать с холодной аудиторией, которую приходится долго разогревать.

Откуда берет данные ВК

ВКонтакте – это Mail.ru. Именно поэтому поисковые запросы под контекстный таргет берутся не только из ВК, но и из других ресурсов, принадлежащих Mail.ru. Например, доска объявлений «Юла», которой часто пользуются автодилеры, а также соцсеть «Одноклассники», поисковик Mail.ru и разные контентные проекты.

Контекстный таргет учитывает не только поисковые запросы, которые пользователь вводит в ВК, но и товары, просмотренные им раньше. Например, человек заходит в какой-то мультибрендовый дилерский центр и видит среди товаров автомобиль КИА. Когда он нажимает на его карточку, это воспринимается системой тоже как поисковый запрос. Это важно, потому что самого поиска ВКонтакте не так много, а вот взаимодействия с товарами гораздо больше.

Как настроить контекстный таргет ВК

Найдите блок «Настройки целевой аудитории». Там есть отдельный подраздел «Ключевые фразы».

Теперь просто добавьте ваши основные ключевые запросы, разделяя их запятой или переносом строки.

Вроде бы всё просто, но человек, уже работавший в этой области, сразу заметит отличие в настройках от контекстной рекламы. В настройках таргетинга мы видим:

геолокацию;
возрастную группу пользователей;
аудиторию, которая за последний месяц искала нужный товар.

Прописав ключевую фразу на русском и английском языках, вы получите нужную вам ЦА. При этом даже довольно узкий ключ может дать обширную аудиторию.

Почему это происходит? Потому что если бы мы работали с контекстной рекламой, мы бы писали каждый ключ отдельно. В принципе в контекстный таргетинг вы также можете заносить отдельно каждый ключевик, если хотите найти людей, которых интересует только эта ключевая фраза. Но если вы введете на русском и английском только главный ключ, то получите все возможные ключевые фразы, которые могут встретиться вместе с этим словом. То есть теперь вам не нужно как в контекстной рекламе вбивать каждую отдельную ключевую фразу. Можно добавить только главный ключ, а остальные «хвосты» будут добавлены автоматически при выдаче.

Это хорошо работает с локальным бизнесом, где количество ключей сильно ограничено. В этом случае вам будут нужны все люди, которые интересуются товаром. Без разницы хотят они его купить, отремонтировать, поменять или найти запчасти. Главное, что при использовании одного ключа мы можем собрать их всех, а затем покажем им актуальную рекламу. Благодаря этому они будут знать современные цены, видеть специальные предложения, а значит смогут поделиться этой информацией с друзьями.

Где искать ключевые фразы

Любой человек, который сталкивался с контекстной рекламой, знает все сервисы для работы с семантикой: WordStat, Key Collector, SpyWords и т. д. Используя любой из этих инструментов либо воспользовавшись сервисами Яндекс и Google, вы сможете быстро собрать семантическое ядро с нужными ключевыми фразами. Но пару вариантов мы разберем подробно.

Подсказки от ВК

Социальная сеть ВКонтакте сама может подсказать нужные ключевые фразы, связанные с товаром или услугой. Когда вы вбиваете в список свои ключи, сам ВК предлагает, чем можно дополнить этот набор. Там есть основная фраза, а есть подфразы. Например, если используете ключевую фразу «Фольксваген», то ВК вам предлагает все виды вариаций, с которыми люди прописывали ключевую фразу. Даже с ошибками. И сразу показывает частотность этих ключевых фраз.

Если нажмете на добавленную ключевую фразу «Фольксваген», то автоматически добавятся все подфразы. Если не хотите использовать весь список подфраз, тогда можете выбрать только нужные. Тогда в контекстный таргетинг добавятся только выбранные вами варианты. Это достаточно удобно, потому что даёт возможность выбрать фразы с нужной частотностью.

Минус-слова

Контекстный таргетинг позволяет добавлять минус-слова. Под основными фразами вы увидите блок «Добавить исключения». Например, нужно продать Фольксваген Поло. Если вы пропишете в списке ключей только слово «поло», то получите не ту аудиторию, на которую рассчитываете. Потому что бывает и водное поло, и конное поло, и одежда поло. Чтобы исключить множественное толкование ключевой фразы, вам нужно добавить в список минус-слов «водное», «конное» и «одежда». Только помните, что когда добавляете исключения, они начинают взаимодействовать со всеми ключевыми фразами.

Найти минус-слова можно просто в поисковике. Вбиваете, например, «минус-слова автобизнес», чтобы получить разные подборки исключений. Правда, перед добавлением их лучше всего вычитать, потому что какие-то минус-слова для вашего бизнеса могут быть неактуальными, поэтому не стоит их слепо копировать – проще будет сразу проверить, чем потом перенастраивать весь контекстный таргетинг.

Период поиска

В настройках КТ есть поле «Период поиска», где можно обозначить количество дней, в течение которых пользователи интересовались указанными фразами. В данный момент этот период в ВК составляет от 1 до 30 дней. Понятно, что период поиска будет разным в зависимости от того, какой товар или услугу вы продвигаете. Например, у меня в автобизнесе цикл принятия решения по покупке товара составляет примерно 3 месяца. Но чем меньше срок, тем более горячая аудитория.

Технические ограничения и требования

Ключевые фразы можно использовать для любых форматов, от новостей до ТГБ. Модели оплаты рекламы – СРС, СРМ и автоматические стратегии, которые предлагает сам ВК. Ограничения:

128 символов в одном ключевом запросе;
150 фраз (включая минус-слова) – это максимальное количество ключевых запросов.

На кого можно настроить

Прежде всего нужно настраиваться на горячую аудиторию. Например, если продаёте автомобиль Kia, то лучше всего использовать фразу «купить Киа». Она сразу ориентирована на людей, которые хотят купить именно этот автомобиль.

Используя настройки контекстного таргетинга можно переманивать аудиторию, которая интересуется товарами конкурентов. Для этого нужно предложить более выгодные условия или уникальное торговое предложение. Правда, не забывайте указывать геолокацию, потому что иначе аудитория будет сильно рассеяна по всей стране. Также можно настраиваться на смежных конкурентов или холодную аудиторию, с которой придется поработать при помощи контента.

Практическая часть

Скриншот показывает объявление, рекламирующее автомобиль Kia. Обратите внимание, что сбоку есть список ключевых фраз, которые сразу ориентированы на людей, собирающихся купить машину.

Дальше у нас есть два варианта настройки.

Можно указать географию в поле «Гео».
Можно добавить географию в ключевую фразу.

Последний вариант поможет охватить аудиторию, которая хочет купить товар в определенном городе, но на данный момент находится не там. Например, человек пишет «купить Киа в Вологде», сидя за компьютером в Рязани. Определить, какой вариант лучше сработает с вашим товаром, можно только через тестирование, поэтому всегда проводите тесты.

Ключи по моделям

Человек хочет Kia Optima. Соответственно, мы в ключевых фразах прописываем название этого автомобиля. Но при этом обязательно добавляем минус-слова.

Реклама по ключам на отдельную услугу

Когда человеку нужна услуга, например, автокредитование, тогда берем ключи «автокредит», «автомобиль в кредит», «авто в кредит» и т. д. Используйте максимум ключевых фраз, описывающих услугу, чтобы максимально охватить аудиторию.

Реклама по ключам. Автообмен

Когда человек хочет обменять свой старый автомобиль на новый. Здесь подбираем ключи «автообмен», «обмен авто», «обмен авто», «авто в трейд-ин» и т. д.

Реклама по бренду

Человеку может быть интересен какой-то конкретный бренд. Более того, он уже может быть владельцем брендовой вещи или постоянным её пользователем. Поэтому в список ключевых фраз нужно добавлять все варианты написания названия бренда, чтобы зацепить всех его поклонников.

Реклама по конкурирующим моделям

Например, у нас есть Kia Seltos, но мы хотим показать рекламу людям, у которых есть автомобиль той же ценовой категории и разновидности (седан, внедорожник). Чтобы это сделать, мы вписываем в список ключевых фраз модели конкурентов, чтобы пользователи, которые ими интересуются, могли видеть и наше предложение.

Реклама по увлечениям

Настраивая рекламу на увлечения, вы работаете с холодной аудиторией. Например, кто может быть заинтересован в автомобиле с большим багажником? Тот, кто увлекается охотой, рыбалкой или туризмом. Выбираем конкретное увлечение, а потом на него моделируем рекламу, от текста до набора ключевых фраз. Если хотите чуть сузить аудиторию, тогда указываете конкретный интерес в нужной графе. Мы указали интерес «автовладельцы», чтобы работать с автовладельцами, которые увлекаются рыбалкой.

Реклама по отраслям

Используйте ключевые фразы, которые ориентированы на аудиторию, занимающуюся конкретным бизнесом. Указывайте в списке ключей те слова, которые касаются их бизнеса. Либо указывайте прямо название предприятия, чтобы его сотрудники или люди, работающие с этой компанией, видели вашу рекламу. Таким образом вы получите узкую и при этом горячую целевую аудиторию.

Реклама по предприятиям

Например, есть крупное предприятие «Северсталь». Мы предлагаем купить автомобиль работникам этой организации. Таких клиентов мы тоже можем искать по ключевым фразам.

Какие ещё могут быть варианты?

Ключи по типам авто: седаны, внедорожники и т. д.
Ключи по конкурентам: название автосалонов и их адреса.
Ключи по смежным конкурентам: автосервисы.
Ключи по профессиям: таксисты.
Ключи по стажу вождения: хотят купить первый автомобиль.

После проведенной кампании вы получите статистику, в которой будет видно, сколько вы потратили денег на каждую конкретную ключевую фразу. Сколько было показов, какой был CTR, какая была цена показа и клика. Но при этом нужно помнить, что в статистике учитываются пользователи, которые могли несколько раз вводить разные ключевые фразы в разное время. То есть в разные показатели статистики может входить один и тот же человек.

Хотите тоже написать статью для читателей Yagla? Если вам есть что рассказать про маркетинг, аналитику, бизнес, управление, карьеру для новичков, маркетологов и предпринимателей. Тогда заведите себе блог на Yagla прямо сейчас и пишите статьи. Это бесплатно и просто

Настоящее и будущее таргета ВКонтакте

14 Июня 2022 года, 11:29

Шрифт:

Оглавление

Что случилось с аукционом?
Как изменилась лента?
org/ListItem»> Каких еще нововведений ждать в ближайшем будущем?
А что насчет аудио и прероллов MyTarget?
И напоследок: лайфхак от эксперта для успешного таргета

Pattern

Коммуникационное агентство Pattern

Вячеслав Прохоров

Digital-евангелист и руководитель команды внешнего продвижения,
ВКонтакте

В марте digital-маркетинг России перевернулся с ног на голову. Мы пообщались с руководителем команды внешнего продвижения ВКонтакте Вячеславом Прохоровым, чтобы понять, как теперь твердо стоять «на руках» и запускать рекламу.

Делимся мыслями, мнениями и советами.

Вернемся в тот самый март и вспомним два ключевых события в сфере digital:

4 марта Роскомнадзор блокирует Facebook*,
14 марта Роскомнадзор блокирует Instagram*.

Бренды пакуют креативы, пользователи восстанавливают пароли, и все вместе переезжают во ВКонтакте.

К чему это привело?

Количество просмотров ленты ВКонтакте выросло на 25% (несколько миллиардов).
В 4 раза увеличилось количество созданных сообществ.
Более 300 000 новых предпринимателей (и это только с 11 по 17 марта) начали тестировать рекламные инструменты.

Резко и мощно увеличилась как аудитория, так и рекламная активность. Чтобы максимально сохранить комфорт и пользователей, и бизнеса, ВКонтакте принял решение повысить требования к качеству контента и модерации.

Так, с 23 мая вступили в силу обновленные требования к рекламным объявлениям:

текст может занимать до 20% изображения,
запрещается изображение алкоголя, табака, денег,
нельзя делать акцент на болезнях и особенностях тела,
не допускается применение коллажей, в том числе формата «до/после»,
текст нельзя писать капсом (исключение – слоганы),
нельзя использовать эмодзи и символы,
обращаться по имени и упоминать возраст тоже нельзя.

Что случилось с аукционом?

Огромный и единовременный прирост рекламодателей привел к перегреву аукциона. Но на полноценную нормализацию работы можно рассчитывать уже в ближайшем будущем: летний сезон влечет за собой естественный спад активностей как со стороны бизнеса, так и рядовых пользователей.

Бизнес начал мигрировать во ВКонтакте, и мы заметили общую ошибку. Рекламодатели используют те же паттерны взаимодействия, которые применялись в других соцсетях. Сейчас мы по-прежнему находимся в ситуации турбулентного рынка, и никто не понимает, что происходит. Поэтому задача платформы – сделать так, чтобы брендам и пользователям было комфортно и уютно между собой коммуницировать, – Вячеслав Прохоров.

Как изменилась лента?

Лента – главный источник информации в соцсети.

А главный принцип успешного продвижения в ней – это качественный контент.

Причем качество – понятие достаточно расплывчатое.

Таким контент получается, когда он находится в рамках культурного контекста пользователя, когда пользователь легко считывает посыл.

Только за апрель ВКонтакте провел огромную работу по оптимизации ленты. Это и поддержка блогеров, которые получают 100% дохода с показов рекламы, и режим экономии данных для пользователей с ограниченным трафиком. Внедрили сразу несколько технологических фичей: приложение для SmartTV, алгоритм музыкальных рекомендаций, звонки из карточек товаров. Открыли доступ сторонним разработчикам к созданию прямых трансляций через API.

Инструменты коммуникации ВКонтакте и Instagram* количественно сильно отличаются. ВКонтакте инструментов гораздо больше: это статьи, подкасты чат-боты, клипы – много всего. И поэтому сейчас не только алгоритмы учатся подбирать релевантный контент для пользователя, но и бизнес заново учится коммуницировать с аудиторией. Для него все новое, все другое, – Вячеслав Прохоров.

60% аудитории российских медиа – миллениалы 20–38 лет, их фокус на публикации задерживается на 20–30 секунд. Второго шанса заинтересовать контентом в ленте не будет, поэтому попадать нужно сразу. Как это можно сделать:

Постоянно экспериментируйте над форматами публикаций. Даже если уверены, что нашли свой, пробуйте новое – это привлечет внимание.
Корректируйте контент-план регулярно на основе статистики сообщества.
Вовлекайте пользователей в коммуникацию и поощряйте активных.

Каких еще нововведений ждать в ближайшем будущем?

Уже несколько лет холдинг VK поддерживает курс на консолидацию продуктов, выстраивание единой digital-экосистемы. Одно из направлений – платформа VK Видео, которая объединяет видео и трансляции ВКонтакте, Одноклассников и других продуктов холдинга.

Теперь работа с платформой доступна сторонним разработчикам. ВКонтакте открыли доступ к инфраструктуре и технологиям для хранения, быстрой загрузки медиафайлов на сайты, в iOS- и Android-приложения, и для работы с видео, прямыми трансляциями, SDK видеоплеером.

Через SDK в продукт встраивается плеер. Формат, качество, разрешение и подходящий кодек в зависимости от устройства определяются автоматически.

Еще один серьезный апгрейд – NFT-платформа для защиты авторского контента. Планируется создать маркетплейс, на котором пользователи смогут продавать уникальный контент в формате NFT-токенов. Их тираж будет ограничен, а распространение – нет: ВКонтакте будет сотрудничать со всеми блокчейн-платформами, которые предоставят интерфейс для размещения токенов. Холдинг также рассматривает возможность создания собственного блокчейна.

Сейчас тем людям, которые только начинают работу с ВКонтакте надо не что-то новое подсовывать, а сориентировать по тому, что уже есть. Конечно, новые форматы будут, социальная сеть не стоит на месте. Но на данный момент в приоритете помочь освоиться и наладить взаимодействие новым и вернувшимся пользователям, – Вячеслав Прохоров.

А что насчет аудио и прероллов MyTarget?

Возвращаясь к идее о консолидации инструментов в формате единого окна, можно сделать вывод, что рекламные возможности площадок VK и MyTarget будут синхронизированы.

Тому подтверждение – платформа VK Реклама, которая уже работает для мобильных приложений. Ее основная цель – как раз объединить и улучшить алгоритмы работы всех продуктов экосистемы VK.

Правда ли, что модерация ночью лояльнее?

Модерация ночью и модерация днем – одинаковый процесс. Сначала происходит автоматическая – проверка формальных признаков объявления, корректности ссылок. Затем ручная. Человеческий фактор не исключен, но идея ночной лояльности – это миф.

И напоследок: лайфхак от эксперта для успешного таргета

Самый лучший лайфхак, если мы говорим про массовую аудиторию рекламодателей, это хотя бы раз прочитать правила размещения рекламы, – Вячеслав Прохоров.

* Компания Meta, владеющая платформами Instagram и Facebook, признана экстремистской и запрещена на территории РФ.

Теги: ВКонтактеРекламаVKТаргет


(Голосов: 4, Рейтинг: 5)

Читайте нас в Telegram — digital_bar

Есть о чем рассказать? Тогда присылайте свои материалы Марине Ибушевой

Таргетинг вконтакте: как настроить в VK

Последние месяцы ВКонтакте «радует» таргетологов и SMM-специалистов новыми правилами модерации рекламы. Сначала компания запретила использовать эмодзи и заглавные буквы, затем сократила объем видимого текста до двух строк, а чуть позже ограничила количество текста на картинках до 20%. Настраивать таргетинг ВКонтакте стало сложнее, а пройти модерацию с первого раза удается лишь опытным специалистам. Причем не всегда.

В этом материале вы узнаете обо всех актуальных правилах модерации и поймете принцип настройки таргетинга ВКонтакте с учетом последних изменений.

Что изменилось в правилах модерации рекламы

Несмотря на многочисленные жалобы таргетологов, кардинальных изменений в правилах размещения рекламы не произошло. Как сообщило официальное сообщество «ВКонтакте для бизнеса», были отредактированы только два пункта:

Пункт 2.1.3: «Текст рекламного объявления должен соответствовать нормам написания слов с заглавной буквы».
Пункт 2.2.1: «Текст не должен занимать более 50%* от общей площади изображения». Чуть позже объем текста на изображениях решили ограничить до 20%.

По словам администрации социальной сети, новый подход к модерации рекламных записей поможет улучшить качество таргетированной рекламы ВКонтакте.

Давайте подробно разберем изменения на примерах.

Новые требования к текстам

Все рекламные объявления в кампании должны соответствовать нормам русского языка или нормам языка, на котором они публикуются. Промо-посты с ошибками и опечатками модераторы отклоняют. Если пару лет назад можно было писать в креативах «Хей, бро, ты чо тормозишь, вписывайся в движуху», то сейчас такое объявление с большой долей вероятности не пропустят. Придется менять tone of voice или использовать такие фразы только в рассылках и постах, которые вы не планируете продвигать.

Прежде чем отправлять креативы на модерацию, рекомендуем проверить тексты на орфографические ошибки и опечатки с помощью любого текстового редактора или специального сервиса типа Orfogrammka.

Промо-посты, в которых присутствуют эмодзи или специальные символы, ВК теперь не пропускает, но вы можете добавить разрешенные спецсимволы, чтобы улучшить визуальное восприятие.

Разрешенные спецсимволы в ВК: ˜ ¡ ¢ £ ¥ § ¨ © ª ® ¯ ° ± ´ ´ µ ¶ · ¸ ¹ º ¼ ½ ¾ Œ œ Š š Ÿ Ž ƒ ˆ є • ‰ › ™ » « ² ³ Š

Использовать заглавные буквы, чтобы привлечь внимание целевой аудитории к выгодам вашего предложения, тоже нельзя. Запрет на капслок действует в отношении текстов рекламных объявлений, а также его нельзя использовать на изображениях промо-постов и в названии сообществ VK.

У этого правила есть исключения. Объявления с общеизвестными аббревиатурами и названиями товарных знаков могут пропустить, но учтите, что наличие заглавных букв в товарном знаке еще придется доказать. Модераторы могут отклонить объявление и попросить прислать скан-копию свидетельства о регистрации товарного знака.

Не пройдет модерацию	Пройдет модерацию
РАСПРОДАЖА!!! Только сегодня скидка 50% на всё!	Переходите на наше КАСКО Скидка — 25% для всех клиентов в июне
СкИдКи в нашем магазине –90% на все товары для дачи	Узнайте больше о налоговых каникулах на официальном сайте УФНС

Требования к изображениям

Модерация изображений для рекламных постов стала еще более жесткой. Причем порой администрация VK толком не может объяснить, почему один креатив одобрили, а другой — отклонили.

Если тезисно перечислять новые требования, то картинки промо-постов должны быть:

качественными — графику «из нулевых» и фото объявлений «на тетрадных листочках» отклонят;

с минимальным количеством текста — он должен занимать не более 20% от размера изображения;

без заглавных букв — обратите на это внимание, когда будете выбирать шрифты;

без агрессивных цветов — «кислота» и вырвиглазные контрасты отклоняются;

без элементов, имитирующих интерфейс приложения и сайта — чтобы не вводить пользователей в заблуждение;

без изображений денежных знаков — показывать кучи купюр и «успешный успех» в VK больше нельзя;

без фото ДО и ПОСЛЕ, сексуального подтекста и шокирующих деталей — после этих нововведений настройка таргета ВКонтакте для фитнес-тренеров, нутрициологов и косметологов усложнилась в разы.

Если вы раньше продвигались в запрещенных соцсетях и пробовали настраивать там таргет, новые правила будут вам понятны. ВКонтакте пытается создать экологичную соцсеть с нормальными креативами в новостной ленте и в текстово-графическом блоке (ТГБ).

Как настроить таргетинг ВКонтакте: пошаговая инструкция

Владельцы сообществ ВКонтакте могут продвигать уже опубликованные посты и создавать объявления с нуля в рекламном кабинете. Если вы хотите продвигать опубликованную запись в группе, проверьте ее на соответствие новым правилам. Администрация социальной сети позволяет отредактировать любой пост в течение недели с момента публикации.

Не успели убрать эмодзи и капслок? В таком случае придется создавать креатив с нуля в рекламном кабинете. Воспользуйтесь нашей инструкцией, чтобы сэкономить время на настройке таргета и быстро пройти модерацию.

Шаг 1: определите цель рекламы

Перед тем как настроить таргетинг ВКонтакте, определите, какой результат вы хотите получить от рекламы:

больше переходов на сайт;
новых подписчиков в сообщество или рассылку;
поток заявок на услуги или товары;
переходы в мобильное приложение или в VK Mini Apps;
установки мобильных приложений;
конверсии любого типа на сайте.

Укажите цель новой кампании, кликнув по кнопке «Создать объявление» и выбрав подходящий формат.

Подсказки под иконками со знаком вопроса облегчают выбор формата

Для большинства объявлений подходит универсальная запись с кнопкой. Если вы хотите продвигать товары или услуги, выбирайте формат «Карусель». Учтите, что их изображения и описания тоже должны соответствовать новым правилам ВКонтакте.

Запускайте рекламу в формате «Карусель», если хотите предложить людям несколько похожих товаров или услуг

Шаг 2: напишите текст объявления с четким призывом к действию

Создайте текст для рекламного объявления с учетом новых правил ВК. Помните про ограничение по количеству символов, иначе в ленту новостей попадет вот такая запись:

Попробуйте написать несколько коротких текстов и оцените эффективность объявлений по количеству переходов или других взаимодействий с постом.

Соблюдайте принцип A/B-тестирования — меняйте только один параметр, чтобы понять, по какой рекламе люди лучше переходят на сайт или в сообщество.

Шаг 3: подготовьте изображение для рекламы

С изображениями для рекламы тоже лучше перестраховаться и создать сразу 3–4 варианта. Не забывайте, что использовать большое количество текста, а также заглавные буквы на картинках нельзя, хотя в этом примере оба правила модераторы проигнорировали:

Текст на изображении занимает больше 20% от общей площади + есть капслок

Шаг 4: настройте аудиторию для показа объявлений

Аудиторию для показа рекламы можно настроить в рекламном кабинете, но более точные данные вам дадут сервисы-парсеры — TargetHunter, Pepper Ninja, Церебро Таргет и т. п.

В рекламном кабинете VK вы можете отобрать аудиторию по геотаргетингу, интересам, возрасту, образованию, должности, а также найти людей, которые состоят в определенных тематических сообществах. С помощью сервисов вы можете спарсить участников пабликов-конкурентов и отобрать среди них самых активных подписчиков.

Работать с такой аудиторией в разы легче. Вы получаете больше теплых лидов с небольшой стоимостью, эффективно расходуя рекламный бюджет.

Шаг 5: выберите способ оплаты рекламы и расписание показа

Для таргета в ВК можно выбрать одну из двух моделей оплаты:

оплата за показы (CPM) — платите за каждую 1000 показов;
оплата за клики (CPC) — платите только за клики по объявлению, причем неважно, сколько раз его увидят пользователи.

Стоимость клика и стоимость 1000 показов вы назначаете самостоятельно. Также вы можете установить суточный лимит — на всю кампанию или на группу объявлений.

Чтобы не показывать рекламу в выходные дни или в нерабочее время, установите расписание показов. Учитывайте, что от этих параметров зависит охват. ВК покажет прогнозируемые значения на этой странице справа.

В блоке «Время показа рекламы» можно указать точные часы работы вашего отдела продаж или службы поддержки.

После настройки всех параметров можно отправлять объявления на модерацию. На проверку креативов в среднем уходит от 2 до 12 часов. Если рекламу одобрят, вы получите SMS-уведомление о запуске таргета.

Выводы

Таргетологам из запрещенных соцсетей будет проще адаптироваться к новым правилам. Недаром SMM-щики шутят, что «модераторы Facebook и Instagram устроились на работу во ВКонтакте».

В новых правилах модерации рекламы нет ничего сверхъестественного. Достаточно пару раз внимательно их прочитать, чтобы научиться без проблем запускать таргет.

В ближайшие месяцы реклама станет более качественной и экологичной. Кому-то такие объявления покажутся слишком скучными и однотипными, но многие вздохнут с облегчением — вырвиглазные креативы и панибратство в текстах порядком надоели.

Количество конверсий теперь в большей степени зависит от качества продукта и вашего контакта с аудиторией. Если вы понимаете ЦА, общаетесь с ней на одном языке и умеете раскрыть выгоды предложения в коротком тексте, продажи будут. А если вы предлагаете купить воздух, используя кричащие заголовки и пустые обещания, то не удивляйтесь отсутствию лидов.

Реклама в социальной сети ВКонтакте, настройка и ведение под ключ в Туле — Onpeak

Настраиваем и ведем таргетированную рекламу в VK — по цене от 15 000 ₽

Главная

Таргет

ВКонтакте

Реклама во ВКонтакте — эффективный метод развития бизнеса в интернете

По статистике, более 46 млн человек в России ежедневно выходят в социальную сеть ВКонтакте ради общения, развлечения и бизнеса. Ведение таргетированной рекламы в VK позволяет получить максимальный охват аудитории, которая наиболее подходит под ваших клиентов.

Профессиональные таргетологи полностью сопровождают рекламные кампании в социальной сети. Предоставляем подробные прозрачные отчеты по многим показателям. Постоянно тестируем новые аудитории и креативы. Настраиваем системы аналитики для ведения более эффективной рекламы во ВКонтакте.

С помощью профессионально настроенной рекламной кампании, вы увеличите продажи ваших товаров и услуг, повысите посещаемость ресурса и охват аудитории. А её точная и детальная сегментация позволит показать рекламу именно тем пользователям, которые наиболее заинтересованы в ваших предложениях.

Бесплатно проконсультируем вас по рекламе во ВКонтакте

Сэкономьте свое время, оставьте заявку на бесплатную онлайн-консультацию в Zoom. Расскажите, какие цели и задачи вы хотите решить с помощью таргетинга, а команда Onpeak проанализирует ваш проект и даст рекомендации по стратегии ведения рекламы во ВКонтакте.

Вы оставляете заявку на нашем сайте, указав свои контакты и адрес сайта.

Свяжемся с вами в течение 1 рабочего дня для согласования даты бесплатной консультации.

Проведем анализ вашего проекта не более чем за два рабочих дня.

В согласованное время созваниваемся с вами в Zoom и обсуждаем все вопросы.

Мы будем рады помочь в развитии вашего проекта.

Этапы предоставления услуги Реклама в ВК

Изучение вашего бизнеса

Перед началом работы мы погружаемся в проект, исследуем ваш продукт, рынок и конкурентов

Сбор целевой аудитории

Определяем портрет вашего покупателя и сегментируем аудиторию

Разработка стратегии

Выбираем оптимальные каналы, форматы и основную линию рекламы во ВКонтакте

Настройка кампаний

Настраиваем рекламный кабинет, форматы и креативы, время показа и многое другое

Настройка аналитики и метрик

Изучаем, насколько эффективно реклама работает на достижение ваших целей, настраиваем аналитику, собираем и анализируем данные

Аналитическая работа и отчет

Принимаем решение по расширению рекламных кампаний и повышению эффективности.

Перед началом работы мы погружаемся в проект, исследуем ваш продукт, рынок и конкурентов

Условия работы и точную стоимость уточняйте у менеджера проекта

Мы знаем, как получать обращения и продажи с таргетированной рекламы во ВКонтакте

Большой опыт настройки и ведения рекламы

Мы имеем опыт ведения рекламных кампаний для разных тематик бизнеса, погружены во все нюансы и тонкости работы с форматами рекламы и интерфейсом рекламного кабинета, а также постоянно повышаем квалификацию своих сотрудников.

Регулярная аналитика рекламных кампаний

Аналитика результатов позволяет оптимизировать стоимость рекламы, сократив расходы и повысив ее эффективность.

Работа на результат

В рамках услуги настройки и ведения рекламной кампании во ВКонтакте мы всегда уделяем максимальное внимание окупаемости инвестиций в рекламу, будь то ROI, стоимость лида и окупаемость в целом.

Нас часто спрашивают

Могу ли я заказать у вас настройку рекламной кампании во ВКонтакте, а вести ее самостоятельно?

Да, мы можем провести единоразовую настройку рекламного кабинета и кампаний.
Но мы не рекомендуем самостоятельно вести рекламу в VK, если у вас нет опыта в этом, по нескольким причинам. Во-первых, в первичную настройку таргетированных кампаний необходимо вносить коррективы для повышения эффективности рекламы. Во-вторых, опытный таргетолог всегда анализирует целевую аудиторию, сегментирует её, и это позволяет значительно сократить рекламный бюджет и ваше время на работу над проектом.

Я уже пробовал вести рекламу во ВКонтакте, и она мне не помогла. Может быть для моего проекта этот канал не подходит?

У вас не было ни одного обращения? Или вы быстро израсходовали рекламный бюджет? Можно предположить, что некорректно была настроена стратегия показов, или допущены иные критические ошибки. Вы можете обратиться к нам за аудитом РК, и мы проанализируем статистику. Мы сможем найти проблемы и точки роста.

Я могу у вас заказать аудит моих текущих рекламных кампаний?

Конечно, мы проводим аудит таргета в ВК и предоставляем отчёт со списком конкретных рекомендаций. Вы можете использовать его для реализации или обратиться к нам за доработками. Для начала просто оставьте заявку на часовую консультацию. Зачастую этого достаточно, и это бесплатно для вас.

Сколько времени необходимо на настройку рекламы VK.com?

Первые рекламные кампании в контакте мы готовы запустить в течение 3-5 дней. При этом активное тестирование и полная настройка рекламной кампании может занимать месяц и даже больше.

как пользоваться программой для улучшения парсинга. Как подобрать данные користевателя

Ранее мы уже рассказывали вам, как можно получить небольшой пассивный доход за помощь установленных программ Google Play для программ помощи. Теперь поговорим о том, как заработать на помощи социальных мероприятий, а также продвинуть свои аккаунты на популярность. Отже, Вже уже нараспев догадался, что речь идет о VKTarget, точнее, о клиенте наподобие популярного сервиса операционной системы Android.

Заработок от VKTarget

Вне зависимости от названия, клиент работает не только с особыми сторонами користувачи во Вконтакте — а также в интеграции с аккаунтами Facebook, Одноклассники, Google+ и Twitter. Сервис построения VKTarget работает в двух режимах. Користувачи, прошедшие регистрацию, могут выступать в роли заместителей и виконавтов. Для справки какое решение Вы можете прикинуться рекламодателем, сделать разницу, и посмотреть статистику того же дня, или проверить разницу на сайте, взяв за заказ копейки.

На самом деле VKTarget просто выигрывает в продвижении. Є клиент, желающий раскрутить свою сторону или спецаккаунт І є спонсор, виновный в виконати замовлення, залучаючи на новые все возможные ресурсы — знайте, друзья сторонних користувачей. Помогая набирать лайки, количество репостов, а также вступая в новые группы, можно выиграть за копейки. Возможно, не большие, но все же копейки.

Не забываем про тех, кто настроил много роботов на виконы и чтобы получить больше мощности, то прокачает свою силовую сторону, а на активной стороне еще и выпьет.

Снятие копеек

VK Target имеет небольшой лимит на усы — 25 руб. Заработанная сумма с растяжкой в течение нескольких дней будет потрачена на электронные гаманты(WebMoney, QIWI или Яндекс Деньги) или на мобильный счет.

Основные характеристики

возможность поднятия уведомлений о новых назначениях;
продвигать самые популярные платежные системы;
позволяет зарабатывать деньги и продвигать свой профиль в социальных сетях. мережа;
история всех выконаных замовлен и предзнаменований сумм;
на вакансию с доп, зарегистрируйтесь и привяжите свой ВК.

Это чудо-программа для автоматического заработка на сервисе накрутки VKTarget через соцсети ВКонтакте. Выигранный признан за новую автоматизацию Процесс работы на этом сайте, и ради насыщенности потока, позволяют достичь неприличного заработка на ваших счетах, с которых вы зарабатываете деньги, вы можете перевести в электронные азартные игры в паре кликов.

Возможность бота

Бот автомат виконання таких глав ВКонтакте, как « Добавление в друзья », « Репост », « Вступление в группу » та « Лайки ». Можно виконуть как усы из них, так и так, как хочешь себе. один час (демо версия, платная больше).
Для разгадывание капчи Бот поддерживает службу Antigate. При вводе ключа к сервису программа отображает текущий баланс.
Возможность установки трюк в секундах для паузы между задачами.
Поддержка работы через прокси серверов .
Программа передана система антибан , для работы со всеми остальными программами реже смотреть фильтры ВКонтакте, при этом минимизируя риски для ваших публичных записей ВКонтакте.
Программа не регистрировать на сайте

Продвигайте более 90 других функций ради нужных вам людей. Підійде как для новичков в устоявшейся рекламной рекламе, так и для профессионалов.

Сегодня я познакомлюсь с вами поближе с помощью этого сервиса и покажу, как использовать основные функции йоги.

Краткий обзор Target Hunter

Из всех парсеров ВК больше всего заслуживает сам Target Hunter — простота побед, ценность того набора функций.

Давайте рассмотрим особенности этой услуги.

Давайте перейдем к следующему. Познакомимся с функционалом Target Hunter.

Функции парсера

После регистрации на стороне вы увидите меню со списком основных функций сервиса. Це:

Как тренироваться в Target Hunter — выбор аудитории по параметрам

Давайте теперь посмотрим, как тренироваться с конкретными инструментами и зачем нужна вонь.

Как выбрать администраторов splnot

Давайте надо выбрать администраторов деревень из быта, чтобы пропагандировать им взаимную поддержку. Неважно, как ми робитимемо — налаштуемо ретаргетинг на ВК , а в личку визг — при этом надо знать этих самих админов.

Логика проста: нам нужно подобрать базу информации о повседневной жизни. Итак, вы могли бы сидеть и болтать через поиск ВКонтакте, а сейчас потратить часок, как TargetHunter?

Останавливаемся на Пощуке — Спильноти — Парольная фраза. Задаем необходимые параметры. За логикой выступлений нам потребуются официальные капиталы компаний, в названиях которых будут слова «жизнь», «ремонт», «компания побудки » и так далее.

Называем нашу задачу (чтобы потом было легко понять, что мы выбрали за основу — назовите осмысленно) и нажимаем «Старт».

Если задача будет вызвана, вам напомнят о правостороннем интерфейсе.

С натиском заданий перед вами появится список шпилек. Всё нормально — берём весь список из хмурого.

Называем список и выбиваем «Создать», затем — «Сохранить».

У нас есть список необходимых купюр, у администраторов пропал выбор. Если нужно забрать — идем в раздел «Збир». Вы просто не знаете там функцию «Администратор», иначе. Необходимо ускорить работу функции «Контакты». Это будет дано спокойным людям, так как администраторы выбирают группы вами.

В качестве дополнительного инструмента можем выбрать либо базу користевателей, либо базу телефонов, либо базу почт. Вы также можете попросить, сами отовсюду расширить данные — например, из блока «Контакты».

При разборе контактов из «Товаров» обратите внимание, что данные будут подхватываться меньше в том случае, так как при нажатии «Написать продавцам» указывается конкретное лицо, а не сонливость, как навязчивая идея.

В результате есть список, который вы можете выиграть для своих целей.

Активные предоплатщики

Вы также можете узнать свою активную аудиторию : так тихо, кто активно лает, репостит, комментирует Как правило, эти люди, как правило, открыто говорят на темы.

Виловитиїх можно для дополнительного инструмента Активности — Спільноти.

Возьмем список выбранных группировок (пусть не повседневный, мы уже выбрали). Вы можете задать нужные параметры: например, редкость тихая, кто активно лает посты или участвует в обсуждениях, или тише, кому видеозаписи лайкаются, или все, кто проявляет наибольшую активность.

Это называется задачей запуска. К кильке хвилина вы будете готовы.

Як Спарситы Батькив

Це завдання виришили. Давайте так: вы запускаете школу раннего развития ребенка у себя, и вы хотите пропагандировать мамы и татамы для маленьких детей, чтобы они учились у вас. Вам нужно выбрать отцов для детей от 4 до 6 лет. Через стандартный рекламный кабинет ВК такие параметры не выставишь.

Эля через Target Hunter можно найти похожую аудиторию. Идем к Пошуку — Батьке. Вам необходимо установить требуемые параметры.

Вик детей можно вводить в течение нескольких месяцев. Можно поставить возраст отцов, их семейный лагерь (правда, нам важно, чтобы ребенок рос в новой семье). Остается задача стать отцом (нам цікаві и мами тати), страны и города.

Называем задачу и начинаем отбор.

Ось ми и вышили завдання — через десятый час у вас на руках будет такой список, который вы сразу можете получить в рекламном кабинете:

Как узнать пару именинников

Продовжимо вишувати найтсікавіши завдання. У нас есть магазин подарков, и мы хотим показать объявление команде, которая поздравляет вторую половинку с днем рождения.

Сломать задачу легко, она состоит из двух этапов.

Первая ступень: мы выбираем именинников.

Ради кого мы едем в Пошук — Дни народов.

Можно задать период, за который нужно знать дни людей, например, за сутки, или диапазон на выбор.

Можно указать имя именинника. Было бы круто сделать предложение: «Вашей половинке скоро 25? А тут у нас є за новую футболку с надписью 25″, в остальном то же самое. Так что ось, реально выбирать основу тихой, кому скоро будет 25.

Приказать стать, страна, место — и вперед.

Готовый список взят из мрака — так что лучше с ним потренироваться.

Другая сцена: разыграть пару на их дни рождения.

Для кого нужна база и инструмент Збир — Пари уже готов.

Сейчас переполняется база именинников и запуск проекта.

За 5 хвилинов у вас на руках будет готовая база.

Как подобрать данные користувачив

Через Target Hunter можно разобрать данные користевателей, а также телефонную почту. Например, тогда можно отрабатывать на добавочный номер или писать в мессенджеры.

Допустим, нам нужны телефоны и предоплатники из быта (продолжаем эту тему). Спильноти был взят нами. Сейчас мы связываем номера телефонов.

За кем едем в Збору — Свяжитесь с користувачив.

Хотим добавить список группировок, можем сказать что хотим подцепить одинаковые контакты и в каком виде видим их налоги, звоним и запускаем задание. Таким образом, вы можете выбрать учетные записи Skype, Twitter, Facebook и LiveJournal.

Также можно выбрать базу корреспондентов в Инстаграм, а так же Вконтакте. Например, мы хотим знать, у кого наши дни рождения в Instagram.

Idemo to Zboru — Instagram; выберите ВК-Инстаграм.

Как и бачите, Target Hunter позволит вам вирешити быть завдання сходо зіловой публики для налаштування рекламной кампании или других целей.

Как добавить готовую базу в свой рекламный кабинет

Вы можете добавить готовую базу в свой рекламный аккаунт. Сделать это можно двумя способами: напрямую из сервиса или через загрузку файла.

Первый путь

В первый раз вам необходимо добавить свой рекламный аккаунт в TargetHunter. Если вы еще не занимались йогой, вы можете это сделать через Кабинет рекламы — Управление.

Теперь вы можете добавить базу данных в свой рекламный аккаунт прямо из TargetHunter.

Если вы выбрали базу, просто откройте список из меню задач и щелкните значок цели.

Другой путь

Для кого вы можете посмотреть список в правом меню, де все наши виконан_ завдання. Выбираем «Сохранить сообщение користевателя в файл» (кнопка с иконкой рядом с ищущим ланцетом).

Текстовый файл будет сохранен на вашем компьютере.

От всех. В строке аудитории будет «Файл». Как будто аудитория очарована без посредников — API заказывает джерел.

С помощью Target Hunter вы можете повиноваться безличному cікавому завдану, за выполнение которого действует функционал социальных мер. Вы можете собирать разные данные, начиная от номеров предоплательщиков и заканчивая номерами телефонов и аккаунтами в других социальных сетях.

Сохраните свою инструкцию по работе с этим сервисом, она вам поможет, как и

Программа «Кликер» признана для проектов VKtarget и VPrka.
Этот бот создан на базе браузера и мы поставили его с алгоритмом дій. Вам достаточно ввести зашифрованные данные, запустить программу и все, программа сама сохранит задание, а вы получите деньги.
Плюсы цієї программы заключаются в том, что:
— Вы можете добавлять количество аккаунтов, что дает вам максимальный доход, вы можете добавлять средства только со стороны проектов, а еще больше денег для проектов на проектах и вы можете зарабатывать .
— автоматическая релогування между аккаунтами, — программа после выконанння нескольких аккаунтов на одном аккаунте автоматически релогинится на другой аккаунт, при этом не вызывая ежедневный пидозр с бирж ПР не из соц. мереж.
— Вы можете отменить программу роботов на 24 года, чтобы не пропустить следующее задание.
— Налаштування для трудовой деятельности.
Минусы:
— не работают на лотке.
— программа работает не на всех ветках бирж ПР, но можно «достать» в ручном режиме, головняк, но не сразу программой. Але, программа пересобирается в стадии постапгрейда и сподіваємося без сучка и задоринки, чистим все до копейки и не только на этих двух проектах.

Теперь к делу программа работает в двух режимах: «тест» и «базовый»
-В базовом режиме для тестирования роботов вам будет доступен 1 рубль + неограниченное количество групп счетов. Программа спишет 3 копейки (с внутреннего счета проекта) за одно «успешно выполненное» задание.
-В тестовом режиме (абсолютно бесплатно) вам будет доступен весь функционал программы как и в базовом, но вы сможете подключить не более двух групп облачных записей, если вы подключите три и более групп облачных записей, программа автоматически переключится в базовый режим.
1 группа аккаунтов в одном аккаунте зарабатывают за один проект на вкт чи впк, например подключение к работе на впк аккаунт вк, твиттер, ютуб, од и є группа аккаунтов.
Регистрация на данный проект закрыта, так что кто-то должен писать сюда «[email protected]» свои адреса вк
После регистрации вам запрещается доступ к сайту, закрытая группа ВК, узнавайте обо всех новостях и можете подавать питание.

Как запустить программу после регистрации?

После прохождения регистрации заходим на сайт, скачиваем программу, и переходим в раздачу для добавления физической записи, на выбор она будет на впк или вкт (можно выбрать будет ли она), поэтому после При регистрации вы получите на почту лист с ключом для шифрования данных (логин/пароль) в виде общедоступных записей социальных мер, с которыми вы будете работать. Итак, ось, завантажили, открываем папку с ботом, посередине будет еще одна программа crypter, уже распознанная для шифрования ваших данных (логин/пароль) социальных сетей, запускаем crypter, вводим логин и пароль и вставляем ключ, который хранится с 32 символами, выбивается длинный код, который вставляется в отдельное поле в разделе для добавления физической записи. После того, как аккаунт был настроен на сайте, все сохраняется и бот запускается, больше ничего читать не надо, поражаюсь как бот выигрывает задание, как не будет так, например, » бот не заходит в соцсети бота», матюкаємося и по новым зашифрованным данным соцсети, в некоторых случаях возникают проблемы, так как логин или пароль не на 100% верны.
Сайт проекта ere-market.ru

Ну с начала и все.

В цель, ввод осуществляется от рефералов. Vktarget (Вктаргет ру)

Буду продвигать ваши услуги накруткой подписей в социальных сетях Вктаргет. По данной статте мы сэкономим вам на еду, заработать можно в Вктаргет.

Если у вас есть є профилей в самых популярных социальных сетях, то я предлагаю вам зарабатывать на всем сервисе Вктаргет.

5 кроксов для заработка в Вктаргет

Рестрация
Додамо Профиль Соцмереж
Висонуємо завдання
Віводимо копейка
Подключаемо партнерскую программу

Первый крокодил. Рестрация Vktarget

Здесь нет сворачивания. В общем, реставрация стандартная. Вы можете зарегистрировать як через кнопки социальных сетей, поэтому, нажав на кнопку восстановления, запомните свою почту.

Написать в админку сайта.

Крокодил другой. dodaamo profile

С другой стороны, нам нужно добавить наши профили из социалистической жизни, чтобы мы могли это сделать. Процесс можно осуществить следующим образом:

Принять натиск мо на байке синяя кнопка — Заробити
Другие додаамо соц бахрома

Вконтакте
Instagram
Одноклассники
twitter
Facebook
Google plus

Затем нажмите на колесо Налаштування и поставьте галочки напротив всех них. С таким чином мы становимся отримувати завдання.

Крокодил третий. висонуємо завдання

Для этого были показаны два крокодила впереди спереди, мы должны быть в курсе наваждения. Потребуется:

Перше — перейти на мощность
Другие — выконувати необходимые дии
Третье — нажать на кнопку Revert

Когда будем менять на рахунок, оплата за виконан будет обеспечена. Все будет смотреться дуже швидко онлайн.

Яки в основном работа на Вктаргет

Запись в профиль, канал
Присоединяйся к спорту
лайк
зробить ретвит
Марвел на видео 9002

Крокодилы. Выведение копеек

Ранее минимальный порог для получения копеек от Вктаргет составлял 25 рублей. Зараза снижена до 15 руб. Если вы достигли минимального порога, нажимайте на силу — против , указанных на картинке.

Хочешь получить копейку в ВКНИ, хочешь купить куди.

На текущий день Вктаргет предложит ближайшие способы заработка за копейки:

Яндекс — Гроши
Webmoney
Моб. телефон
PAYEER
Steam
Advcash

Висновок осуществляется в течение 2-х рабочих дней. Еще долго все будут видеть его на пути. В среднем копейки, приходят к вам с натяжкой 30 хвили.

Снова провибрировали способ виведения, заказали сумку и нажали кнопку — открыть запрос

При отправке инструкции на почту, при восстановлении кода, его нужно будет ввести в поле ввода . Почему ваша заявка должна быть обработана.

Черепок пятый. pidkeymo партнерская программа

Узнать цену можно в специальном кабинете. У вас будет своя реферальная послання, которую вы сможете отображать на сайте или в соц. Если люди пойдут дальше и перейдут на реструктуризацию, вы будете получать 15% от их заработка.

Вктаргет можно заработать

Средняя цена на Вктаргет станет 0,5 руб. За сутки с одного счета можно заработать около 20 рублей, в пассивном режиме. То есть вы просто запускаете свой компьютер и у вас есть сайт Vktarget, когда вы его видите. Если есть новое растение, вы услышите звук будильника.

Когда подключите, нажмите на картинку на картинке. Напишите что-нибудь в окне, нажмите на разрешение.

В середине зарплата на Вктаргет 300-500 рублей в месяц, в пассивном режиме. Если вы добьетесь успеха с децильными счетами, то заработаете больше.

Чтобы заработать больше денег, включите партнерскую программу.

Вктаргет правила

Причины юношеской блокировки регионального рекорда

Аккаунты, по мере опускания считайте ниже, вас могут заблокировать в любой момент, без возможности выведения костив

Выкористання аккаунтов, чтобы отомстить в профиле заведомо недостоверную информацию и зарегистрировался с целью заработка на сервисе VKTarget («фейк», «Пустушки»). Ни рекламодатели, ни сервисы в субаккаунты не входят. Блокировка может быть викликан как скарго реклама конкретного аккаунта, так и виброоткат аккаунтов самим сервисом
Використання более 4 аккаунтов на одного человека. Якшо Разработайте несколько аккаунтов (правда, аккаунтов ваших близких), их может быть не более 4. Регистрация аккаунта будет заблокирована. (Легкие профили, которые ведут к одному гаманецу, ввазаются нужным людям)
Використання автоматических засобив («боты», «программы») для роботов на VKTarget. Наш сервис регулярно предоставляется для дополнительного поведения. Система автоматически заблокирует услугу, будь то користувач, привыкший пользоваться автоматикой

Массовое производство свидомо нездіисненных завдан, хотя и завдан, как внедрить користуачев в Омане с методом отказа от финансовой выгоды
Строительство мстительных материалов, таких как надзор за законом Российской Федерации или морально-этическими нормами
Нецензурная брань, грубые высказывания с административной службой
Публикация грубых комментариев или эпизодических высказываний в адрес рекламодателей
Систематическое нарушение правил приема посетителей

Чесный Видгук о Вктаргет

Тем более я заработал около 300 рублей на Вктаргет. Это не мой основной доход. Я еще больше благодарна, больше рада реальному заработку и отнятому маленькому часу. Заработок на Вктаргет – это не развод, а реальность.

Ну с меня все. Дьякую за уважение!

Как только получите свой заработок, переустанавливайте по кнопкам.

Так же предложу вам перед прочтением статьи в 2018 году 32 способа заработка для новичка!

Приглашаю в свой блог о методах редактирования онлайн! Пою вам, смотрите сервисы разработки, которые позволяют вам зарабатывать деньги. Одним из таких ресурсов является Vktarget, который успешно работает с 2012 года и покорит большую аудиторию Користувачи. О том, какими способами можно заработать на Вктаргет, вы можете узнать в актуальной статистике. Я расскажу вам о фабриках, которые добавят вам дохода, а также дам ценные рекомендации по лучшему заезду. Узнав обо всех особенностях, данных проектом, можно сразу попробовать убрать дополнительные элементы.

Основные способы заработка в проектах Вктаргет

Во-первых, за все, замолвишь слово, дай проекту один из лучших. Вена позволяет зарабатывать деньги, використовуючи аккаунты в таких социальных сетях, как Вконтакте, Одноклассники, Твиттер, Ютуб.

Если вы хотите получить учетную запись в одной из перестрахованных социальных служб, то вы можете начать и начать. Зайдите на эту платформу, зайдите. Пусть вы только пропустите неловкую процедуру восстановления, введя свой адрес электронной почты и придумав соответствующий пароль.

Безпосредно виконуючи завдання в соцсетях … Один из самых продвинутых способов отказа от прихода на сервисе Вктаргет. Закрепив свою сторону от социальных сетей на данном сайте, вы сможете буквально за несколько секунд просмотреть имеющиеся постройки и избавиться от них по низкой цене. Следующее, что нужно сделать, это:

дополнительные друзья;
Подписаться на Rizni Public, Groups and Channels;
писать комментарии или небольшие рекламные посты тоже.

Менеджер, который может зарабатывать, будет доступен из депозита «Доступный» на сайте Вктаргет при авторизации в системе. Если вы перепроверили по запросу и получили запрос, зайдите на сайт проекта и нажмите на кнопку «Доработка», чтобы администратор одобрил запрос и заплатил за вашу копейку.

Беручи участие в партнерской программе …Це видминный способ привлечения пассивного дохода. Суть йоговского полюса в том, что вы (як виконавты, т. е. заместители) и отчисляете бонус к цене. Сумма вина станет 15%, так как вы будете нарываться от суммы виконавтов костыв или от суммы заместителей копейки.

С таким рангом, покликавши в проекте одного соучастника, вы будете постоянно получать доход от своего дохода или заработка. Очевидно, если вы позвоните большему количеству людей, вы сможете проводить больше времени с большим количеством людей.

шукать рефералов можно на любой интернет джерелс, мидл як:

форумы назначенные для заработка;
специальные группы в социальных сетях;
личный паблик или личный блог та ін.

Если вы хотите принять участие в реферальной системе, сверните ссылку на сайт Vctarget в самый низ, узнайте там кнопку «Партнерская программа» и нажмите на нее. Дайте вам две возможности — одна для приема рекламодателей, другая — для посетителей. Скопируйте их и отдайте на удержание.

Отказ от прихода силовой группы в соцсети … Пока у вас есть є собственная духовность, вы можете зарабатывать на новой, зарабатывать на Вктаргет, распространяя рекламные посты или другие материалы. Для других важно напомнить своей группе о хорошем контенте, продвинуть его, а это, кстати, множество фронтенд-площадок.

Важно, чтобы ваши интерфейсные платы стимулировали активность в спортивной индустрии. Чтобы сделать вашу группу более активной или публичной, вы сможете получать более высокую оплату за распространение постов. Если у вас уже есть такой дух, то пожалуйста, половина права сломана.

Можно ли розрахововать по какому заезду?

Во-первых, для всего, скажем, вашего будет лежать в том, какое исполнение для вас важно. Если вы стали вирусными жить на виконанном завдане, то вот такой винный город:

лайкните пост или ролик в любой соц фанфике, вам принесут 0,1 рубля;
подача на аккаунт или канал — около 0,2 руб.
репост-поста оцениваются в 0,1-0,3 рубля;
вход в группу и паблик — от 0,2 до 0,5 руб.

Як бачите, платят очень мало. Цена завязана на том, что при посещении подобных роботов вы выиграете в более випадкив меньше, чем в вилиин.

Осколки за завдання иде в середине 1 хвилина, то в год роботы можно посетить минимум 60 таких завдан. Через 3 года живучести можно урезать от 20 до 100 руб. Есть целая куча непродовольственных товаров для новичков, которым нужна копейка на небольшое количество витрати.

Как только вы их видите, вы приводите на Вктаргет часть участников и зарабатываете деньги, после чего сумма вашего дохода будет откладываться на всех вас. Если вы приведете больше людей, вы сможете получить больше вина в городе. Также полностью осознается користувачивость, так как оперативно фиксируется, чтобы убрать приход с этого сайта или заменить сервисы с прохождением страниц.

Эля Рефералы будут приносить вам только пассивный доход. А как лучше поправить приход и информацию из системы, доцилн? На депозите «Доступный» надо менять не просто фабрику, а первую сумку, можно сказать за последнюю.

Как только я начну раскручивать группу, можно будет установить оплату за пост 50 и более рублей. Есть несколько причин, по которым часть постов здесь для освещения темы группы, активности новых участников и других факторов. Рекомендую купить небольшое количество роз, бачити, если хотите больше денег и заметности, так как сумма оптимальная для депутата.

Вы не подумали о надежде и поддержке данного проекта, я предлагаю вам полюбоваться на экран оплаты, так как я провел свой специальный номер.

Be-like vipad нужно запомнить несколько простых правил:

Датский проект не позволит вам заработать много копеек; отриманных затрат будет достаточно для небольших витражей, оплаты телефонов, коммунальных услуг или не на основании проживания;
если хотите обрезать, то не очень, но это просто небольшой камбэк, до него дойдет 1-3 года;
когда твой приезд лежит только тогда когда ты видишь.

Где вы храните свои доходы?

Є фабрики деяки, напрямую выливайте свой доход на сайт Вктаргет. Основные из них є:

Количество социальных сетей, подключенных к услуге. Працуючи только с одним сайтом (например, Вконтакте), на подходе можно найти меньший наплыв. Если вы хотите подключить все социальные сети, в какой стороне вы можете.
Количество рекламодателей, зарегистрированных на сервисе. Если будет больше активных депутатов, которые смогут пользоваться этим участком, то и для вас, и для тех, кто будет там находиться, будет больше доступных зданий.
Уровень ротации ваших страниц в социальных сетях, а также параметры, которые вы вводили в своем профиле. Такие параметры є стать, вик, мыши тоже живые. Рекламщики призывают вводить параметры, чтобы аудитория слушала саму аудиторию, а не сторонних аудиторов. Кроме того, в некоторых случаях стороны грешат настоящим и раскрученным (маминый номер друзей, несколько постов на стороне, аудио- и видеозаписи и т. д.).

Способы увеличения дохода

Если вы хотите зарабатывать на Вктаргет побольше, Рекомендую зверски уважать за такое удовольствие:

Включите в браузере уведомление о новом товаре. Для всего в специальном кабинете знайте кнопки «Просмотреть» и нажимайте на них. Это позволит вам не пропустить новое поступление, а, следовательно, три ваших новых поступления.
Примите активное участие в партнерской программе. Очнуться, быть-как нечисть придумать и придумать шутку потенциальных сервиторов. У одних людей пассивный доход может быть виден другим, но есть и активный приход.
Подпишитесь на команду, в которой растет ваш аккаунт. Постепенно добавляйте новых друзей, добавляйте фотографии тоже. Не позволяйте вам делать что-либо с другими подобными проектами.
Попробуйте придумать что-то подобное больше часа. Вместо того, чтобы заниматься бесцельным блужданием в социальных сетях, попробуйте работать так же, только на винный город.

Если вы воспользуетесь рядом неудобных рекомендаций, вы сможете получить еще три способа заработка и провести отличный час с корицей. Я благодарен за то, что вам был дан статут коричневатого, и если бы вы знали о тех, по приходу которых можно розраховувати, співпрацючи с данным проектом. Попробуйте сами в таком виде, я подарю вам успех!

Свет вырастает из развития социальной изгороди, чтобы стать небольшой частью нашей жизни, в социальной изгороди spilkuєmos, он порожден знаниями, которыми мы делимся с друзьями и с нашими друзьями, с нашими друзьями, с помощь лайков, с лайками, до заработок без депозита можно добавить новый проект на зарплату. можно занести в категорию «заработок на лайках»

Собирать и я спилкувався, ставить лайки, грабить репосты, вступать в группу и дарить друзьям, але в один день, подумал я «и як заработок на лайках », я знаю этот способ, но на тот момент таких услуг было мало и мало строений. И вот моя основная ветка с 2000 друзей заполнена рекламными постами и людьми, и по количеству рекламных материалов на них она далеко не похожа на ту. Так же, распустив ее мо бажаня заработать деньги , мы с Але не принесли мне малии. Многие мои друзья постоянно говорят мне, что мне что-то плохо, или я не смеюсь над этим.

Если бы я просто исправил свою работу на вктаргет, то фабрика закончилась еще быстрее, и тогда я не появлялся через тех, кто не слишком рекламировался, но в то время социальные проблемы только ремонтировали развитие. Но сам день накрутки лайков, репостов, участников спортивных товаров стал намного важнее, а с развитием социальных сетей вы будете становиться все более и более востребованными.
может заработать на много швидше и больше, ниже на буксы використы специализированные заведены для социального гнездования. На таких проектах невыносимо быть неудобным с высокими ценами, цена на сайты такого типа значительна перед этими осями не только количеством вина за посещение, но и быстротой оплаты доната.
за зарплата за вроде лучшие мамы фейковые аккаунты, если у мам больше 100 друзей. Аккаунты должны быть активными, чтобы система говорила с вами как с активными людьми и давала вам большую работу за посещение. Следует знать, что стемпинг мультиаккаунтов наказуем, поэтому лучше не грабить. Если все таки вас не волновало повреждение, то красивее ковыряйте устройство на одном из прокси для установки, или ТОПовом браузере, это от вас скрыто, если вы нечестны и отдаете свой счет жизни.

Я могу посетить фабрику и заработать копейки в Интернете все сразу из пяти популярных социальных маргиналов, которые можно разъедать, можно трижды примагничивать социальную сторону. Для ВКонтакте его еще больше, для Ютуба и Фейсбука тоже, а для Твиттера и Инстраграма ось совсем простая. Оплата за лайк, вход, подписку, репост, инвайт в зону 40 копеек, и еще деньги, но можно переделать на этот же бокс, там это будет, включи страницу самого простого сотрудника за 25 копеек, войти, сделать репост Духовные товары и многое другое оплата. Минус один — це те, что завод не особо богатый, да и вонь вся одноразовая, а на буксы заводские могут быть не только одноразовые, но и багоразовые, что позволяет делать шкурку день в день и все фабрика, там увидишь и каждый день будешь болеть. Минимальная сумма для выведения коштива составляет 25 рублей. Для звонков с мобильного телефона доступны 3 популярные платежные системы.

Для отримання винного города и всех лишений требуется минимальная поделка Viconati.

1-просто нажмите на фразу и перейдите на сайт объявлений.

2 — Виконати Я подумаю об этом. В этой випадке — цена подписки на канал.

3 Нажмите кнопку «Пересмотреть», чтобы пересмотреть и завершить пересмотр проекта.

Vktarget (Вктаргет) — майданчик для заработка в интернете абсолютно для всех кому он нужен. Не требует никаких вложений и копеечных витрат. Заработать копейки можно просто: можно посмотреть персонал, можно посмотреть профили в соцсетях: ВКонтакте, Фейсбуке, Твиттере и других. Например, присоединяйтесь перед сном, лайкайте фото, делайте репост и записывайте на стену — по цене и копейки избавитесь, так как тогда можно иметь на себе жизненные силы. Розничные цены лежат в форме фабрики, минимальная сумма на вивод 25 российских рублей.

Официальный сайт VkTarget —

Копейки можно перевести на WebMoney, Yandex, Qiwi, Paypal или оплатить с мобильного телефона. Дайте все профили в социальных сетях для улучшения заработка и количества предприятий.

Датский вид абсолютно похож на кожу. Маме нужен доступ в интернет, компьютер и профили в соцсетях.

Рекомендовано: только не жертвуйте своими основными социальными профилями, делайте фейки (детский и профиль ребенка, маленькая страна) или на глазах у троих прокачивайте их (дайте друзьям, лидерам, фото и уже).

Так же можно играть в роли депутата в роли депутата и подменять в соц фреймах на биржах. Например, накручивать фронтпланты в группу, лайки, друзья. Для всего необходимо просто обновить рахуну и оформить регистрацию.

Инфекции можно легко распространить в Интернете, сидя дома.

На этом ресурсе есть два типа участников — виконавты и депутаты. В основном рекламодатели рекламируют свои проекты, группы, видеоканалы и т. д. Вонючи платить только за тех, кто подписался на ваш проект. Виновник неловкой заявке отнимет за копейки. Это просто.
Яка роль VKTarget? Вин — это майдан, на основе которого он мастер. Оплата производится под контролем ресурса, который будет отклонен песенным комитетом. Комиссию платит не виконав, а зам. Другими словами, проект будет обеспечен взаимодействием посетителей и рекламодателей.

Восстановление на VKTarget

Регистрация на всем сайте намного проще. На головной стороне есть две кнопки, теперь просто нажмите на ту, которая соответствует вашему блоку питания. Давайте воспользуемся этой маленькой формой реставрации, мемориалами. Там вам нужно будет указать адрес электронной почты, пароль и показать, что вы знакомы с правилами. Все. Восстановление завершено. Также можно обойтись без всей процедуры, зайдя на сайт за дополнительной помощью, будь то социальная сеть. Це ще зручн_ше. Функции аккаунта не меняются вообще.

VKTarget — это социальный майданчик, чтобы вы могли помочь вам заработать деньги в новых социальных сетях (Вконтакте, FaceBook, YouTube, Twitter, Google+, Instagram). Новый год провозгласить Новые поступления:

висонання несуразных зданий;
Доход, обращения за помощью в силовую группу ВК;
реферальная программа.

Чтобы начать зарабатывать, нужно попасть на аккаунт своей социальной сети. Если у вас больше социальных сетей и больше ключей, у вас будет больше доступа к ним. Як д_знатися, нацепил чи социальную бахрому? На кнопке стоит галочка. Прикрепив? Зафиксируйте деньги, выконуючи завдання, привязанные к соцзащите.

Как заработать на группе за дополнительную помощь VKTarget?

Так же можно отримати не исповеди додатковый дохид, если у вас есть своя группа ВКонтакте. Попасть в аккаунт в VKTarget может любой желающий. Трохи ниже социалистических значков, которые были привязаны к счету (памъятаєш?), Є ряд «Пропоновляй себе на пропитание». Если будешь хлопать на сборе цю, то переверни форму, и если надо, то запомнишь. Они должны заказать группу и часть распространения доносов.

Здесь є один нюанс, необходимо подтвердить, что владельцем группы является сам владелец группы, об этом будет сообщено в инвентаре поющего текста, которым можно воспользоваться при сохранении формы. Кроме того, когда группа связана, текст можно увидеть.

Ну у вас не одна группа, а спагетти, Тим красивее. Вы можете привязать к своему аккаунту и зарабатывать на распространяемой рекламе. Годовой доступный заработок только в группах ВК. Алле, ресурс постоянно подходит к концу, возможно, в ближайшем будущем доход для заработка будет доступен и в соцсетях.

Кроме того, так как будет присоединена одна или несколько групп, вы сможете слышать заявки от рекламодателей, если хотите распространять рекламу по сторонам группы. О, у вас будет возможность пересмотреть, вы это увидите, если не посмотрите. Если вы не можете получить заявление в течение 24 лет, то вы можете уйти с ним.

ВАЖНО: Оглушение виновато на стороне группы, не меньше доб, и списать раханк своего аккаунта в проекте.

реферальная программа

Партнерская программа — это доступная и простая форма заработка на ресурсах VKTarget. Привлечение новых участников за его реферальные взносы. Вонючка станет виконувати завдання, а ты будешь триммувати видсоток с твоих доходов.

Проект зобов’язуется выплачивать тоби 15% с оклада участника, зарегистрированного самостоятельно. Кроме того, если стоит потратить копейки на раздачу рекламы в VKTarget, то же можно установить на уровне 15%. Справочные услуги можно найти в специальном кабинете.

Питаш, де знаешь рефералов? Вы можете получить социальную помощь за помощь. Так как это властный участок, то есть возможность расширить его по бокам.

Выведение костів с VKTarget

Да брось ты горсть денег, как можно заработать на большом количестве ресурсов? Почему-то из самого неуклюжего и интеллигентного метода — виконання завдан. Скажу сразу — ой, ненамного, так что сторону их нужно чаще учитывать. Можно пару лет зарабатывать по 30-40 рублей в день. Это не слишком большая копейка, поэтому, поскольку она невелика, необходимо привязать все очевидные социальные маргиналы к собственному забывчивому послужному списку и увеличить количество друзей.

Ну а если вы хотите зарабатывать на группах ВК, то здесь доход будет намного больше. Платят тем, у кого есть один пост, примерно 200-300 рублей. Постарайтесь максимально раскрутить свою группу, чтобы вы начали приносить какой-то доход.

Я, нарешты, реферальная программа. Выигрыш может быть источником дохода. Здесь главная цель — активное привлечение новых участников. Помните — чем больше рефералов вы наберете, тем больше сможете заработать.

Выведение костів на ремонт с минимальной суммой — 50 руб. Для всех вас можно будет иметь электронный гаманец (а еще красивее — гаманец). VKTarget выводит копейки на следующие гаманты:

КИВИ;
яндекс копейки;
пар;
PayPal;
Вебмани.

Вы также можете добавить новый на свой мобильный телефон. Гроши выплатили не менее 48 лет.

Отзыв о сайте VKTarget

Простой и толковый ресурс, легко попасть в новый. VKTarget имеет хорошую репутацию. Зарегистрируйтесь в VKTarget и начните зарабатывать свой первый миллион!

Рюкзак для ноутбука Volkano Target 15,6 дюйма, мятный/серый VK-7142-MTGR (каждый)

#{текст}

OKView CartCheckout

Доставка от 2 до 5 рабочих дней.

Потратьте от 500 руб. и получите БЕСПЛАТНУЮ ДОСТАВКУ (кроме мебели)

Поиск по категориям
Дом
Каталоги

Ваша корзина пуста.

{{Имя}} х{{кол-во}} {{текст цены}}

Итого {{Общий текст}}

Дом
Сумки для ноутбуков
Рюкзак для ноутбука Volkano Target 15,6 дюйма, мятно-серый (VK-7142-MTGR)

Зарегистрируйтесь и получайте первыми последние предложения и обновления!

Щелкните здесь для получения дополнительной информации о COVID-19

Страна доставки

Южная Африка

Валюта

ZAR (Р)

был успешно добавлен в сравнение товаров.

Сравнить продукты

Имя

Выберите или добавьте новый список желаний.

Перейти к списку желаний

Мы используем файлы cookie, чтобы улучшить ваш опыт покупок в Интернете с нами. Любая информация, собранная через этот веб-сайт, будет использоваться в соответствии с законами PAI и POPI.
Пожалуйста, ознакомьтесь с нашей Политикой конфиденциальности и Условиями использования. Используя наш веб-сайт и услуги, вы соглашаетесь с этими условиями. Закрыть

Выберите свой регион, чтобы проверить наличие и добавить товары в корзину.

Выберите регионEastern CapeFree StateGautengKwaZulu-NatalLimpopoMpumalangaNorthern CapeNorth WestWestern Cape

При переключении между регионами содержимое вашей корзины может быть очищено, так как продукты и их количество могут быть недоступны в выбранном регионе.

Вы уверены, что хотите изменить регион?

Важные моменты

Стоимость возврата товара в рамках нашего стандартного процесса не включает курьерскую плату.

Товары должны быть возвращены в оригинальной упаковке и в товарном состоянии.

Возврат денежных средств по онлайн-транзакциям по кредитным картам занимает 7–10 рабочих дней со дня получения товара в нашем распределительном центре.

Это время выполнения является результатом времени обработки банком.

Предоставьте подробную информацию о продукте
Номер заказа * Пожалуйста, выберите заказ
Продукт * Пожалуйста, выберите продукт
Выберите продукт
Количество * Пожалуйста, укажите количество
Причина * Пожалуйста, укажите причину
Выберите причинуМне больше не нужен этот товарЯ получил слишком много этого товараЯ не получил или получил слишком мало этого товараТовар поврежден или неисправенЯ заказал этот товар по ошибкеЯ получил не тот товарДругое
Описание Пожалуйста, дайте описание
Изображение (необязательно)

Добавить еще один продукт
Личные данные
Имя * Пожалуйста, укажите имя
Фамилия * Пожалуйста, укажите фамилию
Электронная почта * Пожалуйста, укажите адрес электронной почты
Подтвердить адрес электронной почты * Пожалуйста, убедитесь, что адрес электронной почты правильный
10-значный номер телефона * Пожалуйста, укажите номер телефона
Сведения о доставке
Строка адреса 1 * Пожалуйста, укажите адрес
Адресная строка 2 (дополнительно)
Город * Пожалуйста, укажите название города
Почтовый индекс * Пожалуйста, укажите почтовый индекс
Провинция * Пожалуйста, выберите провинцию
Выберите провинциюEastern CapeFree StateГаутенгКвазулу-НаталЛимпопоМпумалангаNorth WestNorthern CapeWestern Cape
Вставка ДНК путем вырезания и вставки с использованием модифицированных CRISPR-ассоциированных транспозаз типа V-K
Новые результаты
Просмотреть профиль ORCIDConnor J. Tou, Просмотреть профиль ORCIDBenno Orr, Просмотреть профиль ORCIDBenjamin P. Kleinstiver
doi: https://doi.org/10.1101/2022.01.07.475005
Abstract
Full Text
Info/History
Metrics
Supplementary material
Preview PDF
Abstract
CRISPR- Ассоциированные транспозазы (CAST) обеспечивают рекомбинационно-независимые вставки ДНК с несколькими тысячами оснований в запрограммированных РНК местах генома. CAST типа V-K предлагают явные технологические преимущества по сравнению с CAST типа I, учитывая их меньший размер кода, меньшее количество компонентов и однонаправленные вставки. Однако полезность CAST типа V-K затруднена механизмом репликативной транспозиции, который приводит к смеси желаемых простых вставок грузов и нежелательных продуктов коинтеграции плазмид. Здесь мы преодолеваем это ограничение, разрабатывая новые CAST с значительно улучшенной чистотой продукта. Для этого мы компенсируем отсутствие субъединицы TnsA в множественных CAST типа V-K, разрабатывая систему CAST с большой последовательностью, интегрирующую самонаводящиеся эндонуклеазы, или систему HELIX. HELIX использует самонаводящуюся эндонуклеазу (nHE), слитую с TnsB, для восстановления 5-дюймовой способности к надрезу, необходимой для двойного разрыва донора ДНК. Используя отличительные особенности систем типа V-K и типа I, HELIX позволяет вставлять ДНК методом вырезания и вставки с помощью до 9Чистота продукта простой вставки составляет 9,3 % при сохранении надежной эффективности интеграции с геномными мишенями. Кроме того, мы демонстрируем универсальность этого подхода, создавая системы HELIX для других ортологов CAST. Мы также устанавливаем возможность создания минимальной 3-компонентной HELIX, упрощая количество белков, которые должны быть экспрессированы. Вместе HELIX оптимизирует и улучшает применение технологий транспозиции на основе CRISPR, устраняя барьеры для эффективных и специфических вставок ДНК, управляемых РНК.
Main
Программируемая вставка многокилопарных последовательностей ДНК в геномы без использования гомологичной рекомбинации и двухцепочечных разрывов (DSB) открывает новые возможности для точного редактирования генома. Методы геномной интеграции обычно основаны на вирусных векторах ^1,2 или транспозонах ^3-7 , оба из которых лишены программируемости и, следовательно, вставляются в геном стохастически, или нуклеазах, связанных с донорами ДНК ^8-10 , которые основаны на цитотоксичности. DSB и механизм гомологичной рекомбинации хозяина. Кроме того, системы рекомбинации у бактерий имеют низкую эффективность ¹¹ без коинтеграции селективного маркера ¹² или контрселекции CRISPR-Cas ¹³ . CRISPR-ассоциированные транспозазы (CAST) представляют собой многообещающий новый подход к программируемым, независимым от рекомбинации вставкам ДНК посредством взаимодействия между механизмом транспозазы и эффектором(ами) CRISPR для прямой транспозиции, управляемой РНК ^14-16 .
Два основных класса CAST, типы I и V-K, обладают различными и взаимодополняющими свойствами. В то время как охарактеризованные CAST типа I проявляют высокую специфичность к мишени и обычно приводят только к предполагаемым продуктам простого вставочного гена ¹⁷ (хотя и с исключениями ¹⁸), большее количество генов Cas, стехиометрическая сложность и размер кодирования могут ограничивать дальнейшее развитие инструментов в других организмах, таких как эукариотические клетки. Кроме того, склонность некоторых систем типа I к двунаправленным вставкам приводит к нежелательной примеси редактирования ¹⁵ ( рис. 1а ). Для сравнения, CAST типа V-K более компактны с точки зрения размера кода, содержат только четыре основных компонента и обеспечивают полную или почти полную однонаправленную вставку. Однако CAST типа V-K приводят к проблемной смеси продуктов простой вставки и коинтеграции генов, последняя из которых состоит из дупликации груза и полной вставки остова плазмиды ^4,6 ( рис. 1b ), и в целом имеют более низкую специфичность ^14,16,17 . Для приложений редактирования генома идеальная технология встраивания ДНК позволила бы создавать программируемые, однонаправленные, независимые от рекомбинации и простые генные продукты вставки с минимальными компонентами и оборудованием минимального размера. Поэтому мы стремились разработать инженерную технологию CAST, сочетающую простоту и предсказуемость ориентации систем типа V-K с чистотой продукта систем типа I.
Рисунок 1. Разработка и характеристика HELIX.
a — c , Схемы CAST типа I и типа V-K и HELIX ( панели a — c соответственно) и их механизмы транспозиции, которые приводят к простой вставке или коинтеграции генных продуктов. d , Рабочий процесс для экспериментов по транспозиции, нацеленных на плазмидные субстраты. e , Транспозиция оценивалась с помощью ПЦР соединения через LE/RE в TS1 в pTarget. Эксперименты проводили с nAniI, слитым с N- или С-концом TnsB, при использовании pDonor без сайтов I-AniI. f , Количественная оценка эффективности интеграции ДНК на плазмидах при использовании ShHELIX и донорной плазмиды с диапазоном расстояний (d) между сайтом I-AniI и LE/RE, оцененным с помощью ddPCR с использованием минипрепарированной ДНК. g , Покрытие ожидаемых продуктов вставки в pTarget из секвенирования с длинным чтением с использованием подмножества примерных простых чтений вставки для ShHELIX и чтений коинтеграции для ShCAST (покрытие из чтений коинтеграции ShHELIX и чтений простого вставки ShCAST опущено для простоты) . h , Распределение длины считывания при использовании ShCAST и ShHELIX с sgRNA, нацеленной на TS1 на pTarget, из данных секвенирования длительного считывания. Верхняя правая панель представляет собой увеличенное изображение пика длины считывания ~8000 п.н. и , Сравнение пропорций продуктов простой вставки и коинтеграции транспонированных продуктов для конструкций ShCAST и ShHELIX при использовании pDonor с сайтами I-AniI в 14 п.н. последовательность чтения. й , k , Чистота продукта транспозиции ( панель j ) и КОЕ ( панель k ) при использовании сайта Lib4 I-AniI на pDonor (с расстоянием 14 п.н. между сайтами Lib4 и LE/RE), которые ранее было показано, что он увеличивает аффинность I-AniI дикого типа в 5 раз. Для панелей f и k среднее значение, стандартное отклонение и отдельные точки данных показаны для n = 3. TSD, дублирование целевого сайта; LE и RE — левый и правый концы транспозона соответственно; sgRNA, одиночная направляющая РНК; ddPCR, капельная цифровая ПЦР.
CAST типа I и типа V-K различаются по наличию или отсутствию субъединицы TnsA, соответственно, одно из основных отличий, определяющее их простое введение для коинтеграции чистоты продукта. Как в транспозонах Tn7, так и в CAST типа I, TnsA и TnsB выполняют реакции разрыва 5” и 3” доноров, соответственно, что приводит к простым вставкам посредством транспозиции вырезания и вставки (, рис. 1a, ). В транспозонах Tn5053 и CAST типа V-K, лишенных TnsA, а также в транспозонах Tn7 и модифицированных системах I типа с каталитически мертвым TnsA ^17,20 , только 3-дюймовый донорский надрез происходит через TnsB. Доноры с одиночным надрезом приводят к значительной доле коинтегратных вставок за счет репликативной транспозиции вместо вырезания и вставки ²¹ ( Fig. 1b ). Таким образом, для создания коинтегративного типа V-K CAST мы предположили, что восстановление отсутствующей функции TnsA путем слияния ортогональной ДНК-никазы с TnsB позволит транспозицию «вырезать и вставить» посредством 5-дюймовых и 3-дюймовых надрезов донора (, рис. 1c). ). Идеальная никаза должна быть небольшой (чтобы добавить в систему минимальный размер кодирования), иметь предсказуемый сайт разрыва и предпочтительность нити, обладать высокой специфичностью для предотвращения непреднамеренного разрыва по мишени или вне ее и функционировать в различных организмах для разработки последующих инструментов. и приложение. Потенциальные варианты включают эндонуклеазы рестрикции ²² , фрагменты Cas ^9,23,24 , каталитическая часть или полный фермент TnsA из CAST типа I или транспозонов Tn7 ²⁵ , или фаговые эндонуклеазы HNH ²⁶ . Однако у каждого из них есть недостатки, касающиеся размера, специфичности последовательности и цепи и / или необходимых белок-белковых взаимодействий.
Одним из семейств ферментов, соответствующих этим критериям, являются самонаводящиеся эндонуклеазы (HEs), которые представляют собой небольшие нуклеазы, способные генерировать DSB с относительно высокой специфичностью. LAGLIDADG HEs (LHE) были использованы для редактирования генома в бактериальных и человеческих клетках из-за их специфичности и их умеренной перепрограммируемости с помощью белковой инженерии или химерной сборки ²⁷ . LHE из Aspergillus nidulans (I-AniI) имеет небольшую кодирующую последовательность (254 аминокислоты), расщепляет асимметричную последовательность-мишень ДНК длиной 19 п. ²⁸ (нАниИ). Кроме того, было показано, что гиперактивный вариант I-AniI, названный Y2 I-AniI, обладает в 9 раз большей аффинностью к родственному ему сайту-мишени ²⁹ . Поэтому мы предположили, что либо nAniI, либо Y2 nAniI могут быть слиты с TnsB, чтобы сделать возможным двойное никирование на донорской плазмиде, необходимое для вставки ДНК путем вырезания и вставки с помощью CAST типа V-K (9).0865 Рис. 1с ). Вместе слияние nHE с TnsB вместе с остальными компонентами CAST образует комплекс CAST с большой последовательностью с помощью HE, или HELIX.
Результаты
Разработка и оптимизация HELIX
Сначала мы определили, может ли nAniI адекватно заменить отсутствие TnsA в транспозоне V-K канонического типа из Scytonema hofmannii (ShCAST) ¹⁴ . Для этого мы сконструировали серию экспрессионных плазмид ShHELIX, каждая из которых содержала: (1) одну направляющую РНК (sgRNA), нацеленную на сайт-мишень 1 (TS1) на отдельной плазмиде-мишени (pTarget), (2) Cas12k, (3) TniQ, (4) TnsC и (5) nAniI, слитые с N- или C-концом TnsB ( Рис. 1d ). Экспрессионные плазмиды ShCAST или ShHELIX котрансформировали донорной плазмидой (pDonor, содержащей груз размером 2,1 т.п.н.) с левым и правым концами транспозона (LE и RE соответственно) в штамм E. coli , несущий pTarget (, рис. 1d). ). Чтобы определить, произошла ли транспозиция при использовании слияний nAniI с TnsB, мы провели ПЦР соединения как LE, так и RE в pTarget на минипрепарированной ДНК из соскобленных колоний. Интересно, что слияние nAniI с N-концом TnsB поддерживало РНК-управляемую вставку ДНК (9).0865 Рис. 1e ). С-концевые слияния nAniI с TnsB не приводили к транспозиции, указывая на то, что С-концевой взаимодействующий с TnsC домен TnsB в меньшей степени приспосабливается к слитым белкам ³⁰ .
Затем мы собрали восемь дополнительных донорных плазмид, несущих переменные расстояния между LE/RE и сайтом-мишенью I-AniI (ориентированных на создание 5-дюймового никеля на pDonor) (, рис. 1f, ). При совместной трансформации экспрессионных плазмид ShCAST или ShHELIX (с N-концевым слиянием nAniI-TnsB) вместе с pDonor в наш штамм pTarget мы наблюдали одинаковое количество трансформантных колоний при использовании конструкций ShCAST и ShHELIX, что указывает на отсутствие дефекта жизнеспособности клеток из-за HELIX. ( доп. рис. 1а ). Мы оценили эффективность интеграции с помощью капельной цифровой ПЦР (ddPCR), а с помощью ShHELIX мы наблюдали диапазон эффективности интеграции при различных интервалах на pDonor, при этом интервал 14 п. н. обеспечивал наивысшую интеграцию (, рис. 1f, ). Удивительно, но ShCAST также продемонстрировал переменную эффективность интеграции в зависимости от расстояния между сайтом I-AniI и LE/RE (где, в отличие от ShHELIX, сайт I-AniI не играет роли в транспозиции). Интервалы в 4–12 п.н. на pDonor приводили к значительно более высокой эффективности вставки, чем pDonor без сайтов I-AniI (9).0865 доп. рис. 1b ). Изменение положения сайта I-AniI модифицирует последовательность, непосредственно примыкающую к LE/RE на pDonor, что позволяет предположить, что состав фланкирующей последовательности, особенно первые 12 п.н., может быть важным фактором, определяющим эффективность интеграции ( Sup. Fig. 1б ). Отдельно мы также провели эксперименты по интеграции с использованием Y2 nAniI, слитого с TnsB (Y2 ShHELIX), и наблюдали значительно меньшее количество колоний с пиковыми числами с интервалом 14 п.н. ( Sup. Fig. 3a 9).0866 и Доп. Примечание. 1 ). Для последующих экспериментов использовали конструкции HELIX со слияниями nAniI-TnsB и pDonors с 14 п.н. между сайтами I-AniI и LE/RE.
Затем мы использовали секвенирование с длительным чтением, чтобы оценить, может ли восстановление 5-дюймового никеля на pDonor с помощью ShHELIX улучшить чистоту продукта по сравнению с каноническим ShCAST. Мы обогатили транспонированные продукты из нашего пула минипрепарированных плазмид (, суп. рис. 2, ), линеаризовали обогащенную плазмидную ДНК и выполнили секвенирование с длительным считыванием, чтобы определить долю простых вставок в коинтегратах ().0865 Рис. 1г-1и ). С ShCAST мы наблюдали 19,39% коинтеграций, что согласуется с предыдущими результатами ⁶ ( рис. 1i ). Поразительно, что ShHELIX почти полностью устранил коинтеграты, что привело к сокращению всего продукта до 0,6% (уменьшение в 32 раза по сравнению с ShCAST; , рис. 1h, и , 1i, ). Кроме того, мы не наблюдали сайты I-AniI в считываниях продукта вставки, предполагая, что 5-дюймовый лоскут, содержащий эти последовательности, удаляется во время разрешения HELIX-опосредованной транспозиции. Мы также выполнили секвенирование с длительным считыванием с помощью Y2 ShHELIX и аналогичным образом наблюдали резкое увеличение чистоты продукта простой вставки (9).0865 доп. Рис. 3b-d ).
Мы также провели серию контрольных экспериментов, чтобы дополнительно охарактеризовать ShHELIX ( Sup. Note 2 ). Во-первых, каталитически аттенуированный вариант I-AniI (K227M, Q171K) уменьшал коинтеграцию в 1,8 раза по сравнению с ShCAST (предположительно из-за неполной инактивации надрезов I-AniI) ( Sup. Fig. 4a ). Во-вторых, pDonor, лишенный сайта-мишени I-AniI, приводил к снижению коинтегратов в 1,7 раза по сравнению с ShCAST ( Sup. Fig. 4a ). Затем эксперименты с использованием pDonor с «перевернутым» сайтом I-AniI, который размещает разрыв на той же цепи, что и разрыв TnsB, привели к 10-кратному снижению коинтегратов (, суп. рис. 4b, ). Промежуточное образование шпильки или промежуточное расщепление Шапиро, индуцированное поражением (в дополнение к возможности низкоуровневой DSB-опосредованной эксцизии груза), может происходить, что приводит к простым продуктам вставки (, Sup. Fig. 4c, ). Наконец, использование сайта I-AniI «Lib4» на pDonor-14, как было обнаружено ранее, увеличивает аффинность I-AniI дикого типа в 5 раз ³¹ , еще больше снизил коинтеграты относительно ShHELIX до 0,23% всех продуктов транспозиции (для 84-кратного снижения коинтегратов по сравнению с ShCAST) ( рис. 1j ). Однако это улучшение чистоты продукта также сопровождалось снижением КОЕ (, Sup. Note 1, и , рис. 1k, ). В целом, ShHELIX в сочетании с сайтом I-AniI, ориентированным на pDonor для создания 5-дюймового разрыва, демонстрирует наиболее заметное увеличение доли простой вставки до процента коинтеграции, что приводит к почти идеальной чистоте продукта на плазмидной мишени.
Характеристика HELIX на геномных мишенях
Воодушевленные нашими результатами транспозиции на плазмидных мишенях, мы затем исследовали эффективность ShHELIX-опосредованной интеграции ДНК в геномные сайты. Мы выполнили трансформации с использованием конструкций, сходных с экспериментами по нацеливанию плазмид, но вместо этого с sgRNAs, нацеленными на геном, и без pTarget (, рис. 2a, ). Во-первых, мы проверили влияние двух аминокислотных линкеров разной длины между nAniI и TnsB на эффективность геномной интеграции в нашем наборе из восьми донорных плазмид, содержащих различные расстояния между сайтами I-AniI и LE/RE. Эксперименты проводили с ранее охарактеризованной sgRNA 9.0967 14 против геномного целевого сайта (TS2). Для обоих аминокислотных линкеров мы наблюдали самую высокую эффективность интеграции при расстоянии 14 п.н. между сайтом I-AniI и LE/RE (, рис. 2b, ), что согласуется с нашими результатами нацеливания плазмиды. Все обнаруживаемые вставки были в ориентации T-LR (, рис. 2c, ).
Рис. 2. Характеристика вставок ДНК на геномных мишенях с помощью HELIX.
a , Рабочий процесс для экспериментов по транспозиции генома. b , Эффективность интеграции при использовании двух разных аминокислотных линкеров между nAniI и TnsB, sgRNA против геномного сайта-мишени 2 (TS2) и набора из восьми донорных плазмид с различными расстояниями между сайтами I-AniI и LE/RE. , как определено с помощью ddPCR. c , Процент ориентации вставки при использовании ShCAST или ShHELIX, нацеленного на TS2, и с использованием pDonor с интервалом 14 п.н. между сайтом I-AniI и LE/RE d , Эффективность интеграции в шести геномных целевых сайтах для ShCAST и ShHELIX (слева панель) и относительную интеграцию с ShHELIX, нормализованную по ShCAST (правая панель), оцененную с помощью ddPCR. e , Покрытие ожидаемых продуктов вставки в геном (TS2) в результате секвенирования с длинным чтением с использованием подмножества типичных простых чтений вставки для ShHELIX и чтений коинтеграции для ShCAST (покрытие из чтений коинтеграции ShHELIX и чтений простых вставок ShCAST опущено для простоты). Транспонированные продукты были обогащены перед секвенированием с помощью целевого обогащения Cas9. f , Распределение длины считывания продуктов транспозиции при использовании ShCAST и ShHELIX на геномном целевом сайте 2 (TS2) из данных секвенирования длительного считывания. Верхняя правая панель представляет собой увеличенное представление пика длины считывания ~8200 п.н. г , Сравнение пропорций продуктов простой вставки и коинтеграции при TS2 для ShCAST и ShHELIX, оцененных с помощью секвенирования с длительным чтением. h , Эффективность интеграции с ShHELIX и sgRNA, нацеленной на TS5, при использовании pDonors, кодирующих грузы различных размеров. Интеграцию оценивали с помощью ddPCR. Для панелей b, d и h , среднее значение, стандартное отклонение и отдельные точки данных показаны для n = 3. LE и RE, левый и правый концы транспозона, соответственно; sgRNA, одиночная направляющая РНК; ddPCR, капельная цифровая ПЦР.
Определив оптимальный сайт I-AniI для расстояния между LE/RE на pDonor для нацеливания на геном, мы затем сравнили эффективность интеграции и чистоту продукта ShCAST и ShHELIX для ряда геномных сайтов. ShHELIX сохранил надежную целевую интеграцию под управлением РНК в шести геномных сайтах-мишенях на уровнях, сравнимых с ShCAST (, рис. 2d, ). Чтобы проанализировать чистоту продукта интеграции HELIX при нацеливании на геном в TS2, мы выполнили секвенирование с длительным считыванием с использованием целевой стратегии обогащения Cas9 ³² . Анализ считываний, обогащенных мишенью, при использовании ShCAST и ShHELIX, которые содержали или не содержали вставку груза, показал, что эффективность интеграции, рассчитанная на основе наших данных секвенирования с длинным считыванием, была аналогична нашим результатам ddPCR на TS2 ( Sup. Fig. 5 ). С помощью ShCAST мы наблюдали, что 46,52% прочтений вставок были коинтегрированными (, рис. 2e-g, ), что в целом ниже, чем наблюдалось ранее, хотя и в отношении другого целевого сайта и с помощью альтернативных методов секвенирования длинных прочтений ¹⁷ . С ShHELIX мы наблюдали только 3,11% коинтегратов, что в 17 раз меньше по сравнению с ShCAST (, рис. 2e-g, ).
Затем мы оценили способность ShHELIX интегрировать ДНК-грузы различных размеров. Мы выполнили трансформации, используя донорные плазмиды, несущие грузы последовательности 5,2, 7,8 или 9,8 т.п.н. (по сравнению с pDonor с грузом 2,1 т.п.н., использованным в предыдущих экспериментах). Для каждой реакции транспозиции с использованием более крупных грузов ShHELIX показал сравнительно высокую эффективность направленной интеграции ДНК независимо от размера груза (9).0865 Рис. 2h ). Вместе наши результаты демонстрируют, что ShHELIX способен к высокоактивным однонаправленным вставкам ДНК методом вырезания и вставки и нечувствителен к грузам размером не менее 10 т.п.о.
Минимизация архитектуры ShCAST и HELIX
В отличие от многокомпонентной сложности CAST типа I, для которой требуется семь или восемь белковых субъединиц различной стехиометрии, мы задались вопросом, можем ли мы еще больше упростить обычно 4-субъединичную архитектуру CAST типа V-K. . Для этого мы разработали трехкомпонентные системы, исследуя слияния различных субъединиц ShCAST. Мы исследовали слияние одного или двух мономеров TniQ с N- или С-концом Cas12k или слияние одного мономера TnsC с любым концом Cas12k (9).0865 рис. 3а ). Слияние либо TniQ, либо TnsC с N-концом Cas12k существенно снижает эффективность интеграции (, рис. 3b, ). С-концевые слияния TniQ с Cas12k сохраняли эффективность интеграции до 62,3% и 69,6% по сравнению с неконденсированным ShCAST, когда один или два мономера TniQ были слиты соответственно (, рис. 3b, и , суп., рис. 6a, ). . Мы также наблюдали, что слияние мономера TnsC с С-концом Cas12k сохраняет относительно высокую эффективность интеграции (9).0865 Рис. 3b ). Учитывая предполагаемую критическую роль образования филаментов TnsC для транспозиции ^30,33-35 , мы предполагаем, что филаментация все еще может происходить, несмотря на слияние Cas12k, или что только одного мономера достаточно для обеспечения транспозиции посредством неканонического механизма ( Приложение 3 ).
Рис. 3. Эффективность интеграции трехкомпонентных систем CAST и HELIX.
a , Схема архитектур слияния для создания 3-компонентных ШКАСТов. b , Эффективность интеграции, нормализованная к канонической, 4-компонентной системе ShCAST для каждой 3-компонентной системы ShCAST, как определено с помощью ddPCR (см. Sup. Fig. 6a для абсолютных уровней интеграции). c , Схема 3-х компонентных систем ШХЕЛИКС. d , Эффективность интеграции нормализована для 4-компонентной системы ShHELIX для каждой 3-компонентной системы ShHELIX (см. Sup. Fig. 6b для абсолютных уровней интеграции). Для панелей b и d среднее значение, стандартное отклонение и отдельные точки данных показаны для n = 3,
Затем мы определили, были ли аналогичные слияния Cas12k аналогичными функциональными в контексте 3-компонентных систем HELIX (, рис. 3c, ). Мы выполнили преобразования с использованием слияний Cas12k-TniQ, Cas12k-TniQ-TniQ или Cas12k-TnsC вместе с оставшимися модулями HELIX и оценили эффективность интеграции. Мы наблюдали РНК-управляемую интеграцию между 22-36% при TS2 и 15-49% при TS5 в зависимости от используемой архитектуры слияния (, рис. 3d, и , суп., рис. 6b, 9).0866). Секвенирование ампликонов следующего поколения показало, что 4- и 3-компонентные системы ShCAST и ShHELIX демонстрируют одинаковый профиль расстояния вставки PAM-LE (, суп. рис. 7, ), показывая, что слияния nAniI-TnsB и слияния TniQ или TnsC Cas12k, отдельно или в сочетании, не изменяет это свойство. Эти результаты демонстрируют возможность создания систем HELIX с меньшим количеством субъединиц путем слияния компонентов и подчеркивают возможности белковой инженерии для создания трехкомпонентных версий, демонстрирующих сопоставимую эффективность интеграции.
Расширяемость HELIX для ортологов CAST типа V-K
Во всех обнаруженных CAST типа V-K отсутствует TnsA ³⁶ . Это наблюдение поддерживает эволюционную гипотезу о том, что Tn5053-подобный транспозон, содержащий TnsB, TnsC и TniQ, но не TnsA, ассимилировал и перепрофилировал эту систему CRISPR ¹⁹ . Следовательно, ожидается, что все CAST типа V-K будут действовать посредством репликативной транспозиции, приводя к существенной доле нежелательных продуктов коинтеграции. Таким образом, мы исследовали HELIX в качестве универсального подхода, позволяющего вставлять ДНК методом вырезания и вставки с другими V-K CAST различных типов (9).0865 Рис. 4а ).
Рис. 4. Расширение HELIX для ортологов CAST типа V-K.
a , Филогенетическое дерево, иллюстрирующее разнообразие последовательностей TnsB из недавно идентифицированных CAST типа V-K ³⁶ CAST, использованные в настоящем исследовании, а также Tn5053, отмечены. b , конструкции sgRNA для AcCAST. c , Эффективность интеграции с AcCAST с использованием двух конструкций sgRNA (из панели b ) и донорной плазмиды с нативной фланкирующей последовательностью (как сообщалось ранее ¹⁴ ) или фланкирующей последовательности ShCAST, оцененной с помощью ddPCR. d . Схема AcHELIX с фланковой последовательностью ShCAST из 14 п.н. на pDonor. e , Покрытие продуктов вставки в геном (TS2) в результате секвенирования с длинным чтением, отображающее выборку типичных простых чтений вставки для AcHELIX и чтений коинтеграции для AcCAST (покрытие из чтений коинтеграции AcHELIX и чтений простых вставок AcCAST опущено для простоты). Транспонированные продукты были обогащены перед секвенированием с помощью Cas9.целенаправленное обогащение. f , Распределение длины считывания продуктов транспонирования при использовании AcCAST и AcHELIX на TS2 из данных секвенирования длительного считывания. Верхняя правая панель представляет собой увеличенное представление пика длины считывания ~8,3 т.п.н. г , Сравнение пропорций продукта простой вставки и коинтеграции для AcCAST и AcHELIX, оцененное с помощью секвенирования с длительным чтением. h , i , Эффективность интеграции в ориентациях T-LR и T-RL (панели h и и соответственно) в шести геномных целевых сайтах для AcCAST и AcHELIX, оцененных с помощью ddPCR. На панели h эффективность интеграции AcHELIX T-LR по сравнению с AcCAST показана на правой панели. Все трансформации содержат вариант pDonor с флангами ShCAST и интервалом 14 п.н. между сайтами nAniI и LE/RE. j , Эффективность интеграции при использовании AcHELIX с использованием sgRNA, нацеленной на TS6, и pDonors, кодирующих грузы различных размеров, оценивали с помощью ddPCR. к . Схема ShoHELIX с фланковой последовательностью ShCAST из 14 п.н. на pDonor. l , Покрытие ожидаемых продуктов вставки в геном (TS2) в результате секвенирования с длинным считыванием, отображающее выборку типичных простых считываний вставок для ShoHELIX и считываний коинтеграции для ShoCAST (покрытие из считываний коинтеграции ShoHELIX и простой вставки ShoCAST чтения опущены для простоты). Транспонированные продукты были обогащены перед секвенированием с помощью обогащения мишени Cas9. m , Распределение длины чтения при использовании ShoCAST и ShoHELIX на геномной мишени (TS2) из данных секвенирования длительного чтения. n , Сравнение пропорций продукта для простой вставки и коинтеграции для ShoCAST и ShoHELIX, оцененное с помощью секвенирования с длительным чтением. o , p , Эффективность интеграции в ориентациях T-LR и T-RL (панели o и p соответственно) в шести геномных целевых сайтах для ShoCAST и ShoHELIX, оцененная с помощью ddPCR. q , Эффективность интеграции при использовании ShoHELIX с sgRNA, нацеленной на TS3, и pDonors, кодирующих грузы различных размеров, оценивалась с помощью ddPCR. Все трансформации ShoCAST и ShoHELIX содержат вариант pDonor с флангами ShCAST. Для 9Панели 0865 c, h — j и о — q , среднее значение, стандартное отклонение и отдельные точки данных показаны для n = 3. LE и RE, левый и правый концы транспозона, соответственно; sgRNA, одиночная направляющая РНК.
Чтобы исследовать применимость HELIX к другим ортологам CAST, мы охарактеризовали и оптимизировали два ранее опубликованных CAST типа V-K либо из Anabaena cylindrica (AcCAST), либо из другого штамма Scytonema hofmannii (ShoCAST). Во-первых, для канонической системы AcCAST мы разработали два каркаса sgRNA (9).0865 Fig. 4b ) и две архитектуры pDonor, последняя из которых различалась тем, что содержала различные последовательности из 25 п.н., фланкирующие LE и RE (либо как сообщалось ранее для AcCAST ¹⁴, либо с использованием фланкирующих последовательностей ShCAST). С двумя конструкциями sgRNA, которые различались в зависимости от их точек слияния crRNA-tracrRNA, мы наблюдали лишь скромную разницу в эффективности интеграции (, рис. 4b, и , 4c, ). Однако pDonor, содержащий фланкирующие последовательности ShCAST, приводил к повышенной абсолютной эффективности интеграции 190,6% или 20,4% для sgRNA-1 и sgRNA-2 соответственно (увеличение в 1,28 и 1,31 раза по сравнению с pDonor с нативными флангами AcCAST; , рис. 4c ). Как мы ранее наблюдали для ShCAST ( Sup. Fig. 1b ), эти результаты предполагают, что последовательности, непосредственно прилегающие к LE и RE на pDonor, являются важной детерминантой эффективности CAST-опосредованной интеграции типа V-K. Принимая во внимание последовательности флангов, а также другие потенциальные детерминанты эффективности интеграции, такие как число копий pDonor ( доп. Рис. 8 ), позволяют оптимизировать различные CAST. Кроме того, AcCAST показал минимальное, хотя и все еще обнаруживаемое, количество вставок, ориентированных на T-RL, что делает его почти полным однонаправленным вставочным устройством (, рис. 4b, ).
Мы сконструировали AcHELIX, включающий гибрид nAniI-TnsB вместе с конструкцией sgRNA-2 и pDonor, содержащий сайты I-AniI в 14 п.н. от LE/RE, разделенные фланкирующей последовательностью ShCAST (, рис. 4d, ). Чтобы определить чистоту продукта интеграции с AcHELIX по сравнению с AcCAST при нацеливании на геном, мы выполнили секвенирование с длительным считыванием после Cas9.обогащение мишени ( рис. 4e ). В то время как с AcCAST мы наблюдали 37,83% продуктов коинтеграции, для AcHELIX мы обнаружили только 0,71%, что представляет собой 53-кратное улучшение чистоты продукта с AcHELIX (, рис. 4f, и , 4g, ). В шести геномных мишенях AcHELIX сохранил сравнимую с AcCAST интеграцию ДНК под управлением РНК и направленность вставки (, рис. 4h, и , 4i, ). Кроме того, как и ShHELIX, AcHELIX не продемонстрировал снижения эффективности при интеграции грузовых последовательностей различных размеров до 90,8 кб, сохраняя эффективность интеграции более 83% для всех четырех размеров груза в TS6 (, рис. 4j, ). Таким образом, подобно ShHELIX, AcHELIX представляет собой эффективный сконструированный CAST с почти идеальной чистотой продукта простой вставки для вставок ДНК различных размеров.
Затем мы охарактеризовали ShoCAST и ShoHELIX с использованием pDonor с интервалом 14 п.н., разделяющим сайт I-AniI, и LE/RE с фланкирующей последовательностью ShCAST (, рис. 4k, ). Мы провели эксперименты по нацеливанию генома с помощью ShoCAST и ShoHELIX, используя ранее описанную sgRNA 9.0967 16 против TS2. Характеристика продуктов вставки с помощью длительного секвенирования выявила 54,61% коинтегратов для ShoCAST и 20,54% для ShoHELIX, демонстрируя 2,6-кратное снижение коинтегратов при использовании ShoHELIX (, рис. 4l-4m ). Для геномных мишеней TS2-TS7 мы наблюдали диапазон эффективности интеграции, при этом ShoHELIX демонстрировал сопоставимую интеграцию с ShoCAST (, рис. 4o, ). Подобно AcCAST и AcHELIX, направленность вставок ShoCAST и ShoHELIX была преимущественно в ориентации T-LR, хотя и с минимальными, но обнаруживаемыми вставками T-RL (9).0865 Рис. 4o и 4p ). Кроме того, в отличие от ShHELIX и AcHELIX, ShoHELIX показал снижение эффективности интеграции с увеличением размера груза на pDonor при TS3 (, рис. 4q, ).
Обсуждение
CAST — новый класс технологий редактирования генома, которые позволяют программировать вставки ДНК, не полагаясь на рекомбинацию, специфичные для последовательности рекомбиназы или DSB. Однако открытые и охарактеризованные в настоящее время системы типа I и В-К имеют ограничения, ограничивающие простоту их использования, в том числе размер ( доп. рис. 9 ), стехиометрическая сложность и сложность компонентов и/или чистота продукта введения. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали HELIX, которая использует технологические преимущества CAST типа V-K и использует слияние nHE и модифицированную донорную плазмиду для достижения программируемой и эффективной вставки ДНК путем вырезания и вставки, аналогичной CAST типа I. Мы показываем, что HELIX резко повышает чистоту продукта простой вставки на плазмидных и геномных мишенях в E. coli и сохраняет надежную транспозицию под управлением РНК на уровне дикого типа или близком к нему. Кроме того, мы показываем возможность упрощения систем CAST и HELIX до трехкомпонентных систем путем слияния субблоков с Cas12k, полезность которых будет улучшена будущими инженерными усилиями по повышению эффективности их интеграции. Вместе наши подходы являются первым описанием технологии CAST и подчеркивают, как можно использовать другие встречающиеся в природе ферменты для улучшения свойств CAST.
Мы демонстрируем, что HELIX эффективен для трех ортологов CAST типа V-K, подтверждая универсальность этого подхода. Продолжающееся открытие CAST не только позволит выявить новые системы с полезными характеристиками, но также создаст платформу для разработки технологий HELIX следующего поколения с разнообразными и полезными свойствами. Продолжающееся метагеномное открытие CAST выявило множество архитектур транспозонов с рядом свойств, включая компактные CAST типа V-K, которые могут оказаться полезными для приложений редактирования генома ³⁶ . Оптимизация свойств HELIX для каждого ортолога CAST (например, аминокислотные линкеры, промежутки между сайтами nHE и LE/RE, выбор nHE, фланкирующие донорные последовательности и т. д.) приведет к более высокой эффективности транспозиции при одновременном использовании уникальных свойств каждого CAST.
Среди нашей характеристики CAST мы также обнаружили, что фланкирующее секвенирование, непосредственно примыкающее к LE/RE на pDonor, может влиять на эффективность интеграции. Это открытие предполагает, что будущие усилия по лучшему пониманию и увеличению фланкирующих последовательностей и потенциально других параметров CAST обещают дальнейшее повышение эффективности транспозиции. Более полное понимание факторов, определяющих эффективность интеграции CAST и HELIX и чистоту продукта (например, фланкирующие последовательности донора, выбор целевого сайта, размер груза, более полное определение PAM и т. д.), а также специфичность будут иметь решающее значение при разработке и настройка этих систем.
Подводя итоги, можно сказать, что HELIX представляет собой обобщающий подход, который обеспечивает программируемые, вырезающие и вставляемые, однонаправленные вставки ДНК с минимальным количеством компонентов и независимые от рекомбинации без DSB. Усилия по созданию высокоспецифичных и гиперактивных вариантов CAST типа V-K, потенциально с помощью инженерии TnsC и Cas12k или TnsB и Cas12k соответственно, могут принести пользу системам HELIX следующего поколения. Параллельно с этим HELIX обладает потенциалом для расширения использования CAST для различных организмов, учитывая его улучшенную субъединицу, стехиометрию и простоту механизма вставки. В целом, HELIX демонстрирует перспективу применения инженерных подходов для оптимизации и преодоления ограничений CAST с последствиями для разработки оптимальных технологий вставки ДНК.
Вклады
C.J.T задумал идею, спроектировал и провел эксперименты, а также написал черновой вариант рукописи. Б.О. провел эксперименты для ShoHELIX и сравнения размеров груза. Б.П.К. участвовал в планировании эксперимента и руководил исследованием. CJT и B.P.K. отредактировали рукопись; все авторы одобрили рукопись.
Конкурирующие интересы
C.J.T. и B.P.K являются изобретателями патентов и/или патентных заявок, поданных Mass General Brigham, которые описывают технологии геномной инженерии. Б.П.К. является консультантом Avectas Inc., EcoR1 Capital и ElevateBio, а также советником Acrigen Biosciences, Life Edit Therapeutics и Prime Medicines.
Доступность данных
Все данные секвенирования будут храниться в архиве NCBI Sequence Read Archive (SRA).
Методы
Плазмиды и олигонуклеотиды
Все плазмиды, использованные в этом исследовании, и выбранные последовательности перечислены в Дополнительной таблице 1 . Новые плазмиды были созданы с помощью изотермической сборки или сборки Golden Gate, некоторые из которых были депонированы с помощью Addgene (, дополнительная таблица 1 ). Плазмиды pHelper и pDonor для ShCAST и AcCAST, а также pTarget были подарены Feng Zhang (номер плазмиды Addgene 1279).21, 127924, 127923, 127925, 127926). Для плазмид, кодирующих гРНК, спейсерные последовательности клонировали в плазмиды pCAST и pHELIX посредством сборки Golden Gate с SapI (New England Biolabs, NEB). Особенности сайта-мишени для всех гРНК, использованных в этом исследовании, приведены в дополнительной таблице 2 . Олигонуклеотиды и зонды, используемые в этом исследовании, были приобретены у Integrated DNA Technologies (IDT) и перечислены в дополнительной таблице 3 . Фрагменты гена для клонирования конструкции были заказаны в Twist Biosciences; синтетический SpCas9sgRNA были заказаны у Synthego (, дополнительная таблица 2, ).
Реакции транспозиции, направленные на плазмиды и геномные сайты
Трансформации для экспериментов по нацеливанию плазмид проводили в химически компетентных клетках PIR1, содержащих pTarget (исходный штамм PIR1, полученный от Invitrogen), с использованием 25 нг pCAST или pHELIX и 25 нг pDonor. Трансформированные клетки восстанавливали в течение 1 часа при 37°C в S.O.C. и затем высевали на чашки с агаром LB, содержащие 50 мкг/мл канамицина, 25 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл карбенициллина. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 18 часов. Колонии подсчитывали, соскребали и экстрагировали плазмидную ДНК с помощью минипрепарата (Qiagen). Полученный пул плазмид использовали для последующего анализа с помощью соединительной ПЦР и секвенирования с длинным считыванием. ПЦР соединения анализировали с помощью капиллярного электрофореза QIAxcel (Qiagen) и визуализировали с помощью программного обеспечения QIAxcel ScreenGel (v1. 5.0.16; Qiagen).
Трансформации для экспериментов по нацеливанию генома выполняли с использованием клеток PIR1 (или клеток PIR2 (Invitrogen) для Sup. Fig. 7 ) и 25 нг pCAST или pHELIX и 25 нг pDonor. Трансформированные клетки восстанавливали в течение 1 часа при 37°C в S.O.C. и затем высевали на чашки с агаром LB, содержащие 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл карбенициллина. Для трансформаций, включающих плазмиды ShCAST, ShHELIX, ShoCAST или ShoHELIX, планшеты инкубировали при 37°C в течение 18 часов; для трансформаций AcCAST и AcHELIX планшеты инкубировали при 37 °C в течение 24 часов из-за сравнительно меньших колоний (хотя их количество было приблизительно одинаковым). Колонии соскребали и гДНК собирали с использованием набора для очистки геномной ДНК Wizard (Promega) для последующего анализа с помощью ddPCR и секвенирования с длительным считыванием.
Оценка эффективности интеграции с помощью ddPCR
Плазмидную или геномную ДНК сначала нормализовали до 10 нг/мкл или 100 нг/мкл соответственно, а затем дополнительно разбавляли до 0,2 нг/мкл или 2 нг/мкл рабочих растворов соответственно для анализы ддПЦР. События вставки измеряли с использованием целевых праймеров и донор-специфического зонда (, дополнительная таблица 3, ). Реакции ddPCR содержали 20 пг плазмидной ДНК или 2 нг гДНК, 250 нМ каждого праймера, 900 нМ зонда и супермикс ddPCR для зондов (без dUTP) (BioRad) в 20 мкл реакций, а капли генерировали с использованием автоматического генератора капель QX200 ( БиоРад). Условия термоциклирования: 1 цикл (95°С 10 мин), 40 циклов (94°С 30 сек, 58°С 1 мин), 1 цикл (98°С 10 мин), выдержка при 4°С. Продукты ПЦР анализировали с помощью устройства для считывания капель QX200 (BioRad), а абсолютное количество вставок определяли с помощью QuantaSoft (v1.7.4). Также анализировали общую матричную ДНК и рассчитывали эффективность интеграции по вставкам/матрице*100.
Длинное секвенирование плазмид и геномных интеграций
Чистоту продукта интеграции анализировали с помощью длинного секвенирования с использованием плазмид, полученных в результате реакций транспозиции плазмид. Транспонированные продукты обогащали путем электропорации примерно 100 нг плазмидного пула в электрокомпетентные клетки Endura (Lucigen), которые представляют собой не-PIR штамм, который ограничивает рекомбинацию. Клетки восстанавливали в течение 1 часа при 37°C в S.O.C. и распределяли по чашкам с агаром LB, содержащим 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Планшеты инкубировали при 30°C (для ограничения рекомбинации) в течение 24 часов, соскребали и экстрагировали плазмидную ДНК с помощью минипрепарата. Обогащенные плазмиды расщепляли EcoRV (NEB) в течение 8 часов при 37°C. Подготовка библиотеки для секвенирования без амплификации (Oxford Nanopore Technologies, SQK-LSK109)) выполняли с использованием набора расширения штрих-кода (Oxford Nanopore Technologies, NBD-104). Окончательную объединенную библиотеку загружали в проточную кювету R9.4.1 и секвенировали в течение 24 часов.
Для проведения длительного секвенирования целевых вставок генома мы выполнили протокол целевого обогащения Cas9 без амплификации для селективного улучшения секвенирования предполагаемых сайтов-мишеней (Oxford Nanopore Technologies, SQK-CS9109; sgRNA, перечисленные в дополнительной таблице ). 2 ). Полученная библиотека была загружена на R9..4.1 проточная ячейка и секвенирование в течение 30 часов.
Обработка данных долгосрочных результатов секвенирования
Файлы Fast5 вызывались в режиме реального времени с помощью Miknow (v21.06.9) с моделью быстрого базового вызова, а полученные файлы FastQ были отфильтрованы для оценки Q > 8. BBDuk из Пакет BBTools ³⁷ использовали для фильтрации ридов, содержащих 20 п.н. LE, RE и последовательность спейсера целевого сайта с максимальным расстоянием Хэмминга 2. Из этих чтений те, которые содержат последовательность 20 п.н. (с максимальным расстоянием Хэмминга 2 ), обнаруженные в остове плазмиды (не ожидается, что они появятся в продуктах простой вставки), были классифицированы как потенциальные коинтеграты, а те, которые не содержат эту последовательность, были классифицированы как потенциальные простые вставки. Чтения для экспериментов по нацеливанию на плазмиду дополнительно отфильтровывали для соответствующей длины чтения. Чтения, содержащие продукты, назначенные как простые вставки или коинтеграции, были объединены в один файл FastQ и сопоставлены либо с синтетической простой вставкой, либо с продуктом коинтеграции с Minimap2 ³⁸ указывается параметром map-ont . Графики покрытия были созданы на основе примерного набора из 100 прочтений с использованием Geneious (v2021.2.2) и его встроенного выравнивателя (средняя чувствительность и повторение до 5 раз). Также были созданы файлы Sam, содержащие выровненные чтения, которые использовались для создания гистограмм длины.
Анализ расстояния вставки с использованием целевого секвенирования
Расстояние вставки от PAM до LE оценивали с помощью секвенирования следующего поколения с использованием метода конструирования библиотеки на основе двухэтапной ПЦР. 50 нг геномной ДНК из экспериментов по нацеливанию на геном подвергали ПЦР-амплификации с 30 циклами с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Q5 (NEB) и праймеров, которые связываются сразу за пределами TS2 или сразу внутри LE. Продукты ПЦР очищали с использованием парамагнитных шариков, приготовленных, как описано ранее 9.0967 39,40 . 20 нг очищенного продукта ПЦР использовали в качестве матрицы для второго 10-циклового ПЦР для добавления штрих-кодов Illumina и последовательностей адаптеров. Продукты ПЦР перед количественным определением очищали с помощью QuantiFluor (Promega) и объединяли в эквимолярный пул. Конечные библиотеки были количественно определены с помощью количественной ПЦР (набор для количественной оценки библиотек KAPA; Roche 7960140001) и секвенированы на MiSeq с использованием набора v2 на 300 циклов (Illumina).
Обработка данных целевых результатов секвенирования
Парные чтения FastQ сначала были отфильтрованы для Q>30 с помощью BBDuk из набора BBTools и объединены с помощью BBMerge. Затем были извлечены чтения, содержащие 20 п.н. TS2 и 20 п.н. терминального LE, каждое с максимальным расстоянием Хэмминга 1. Каждое чтение затем удаляли из последовательности выше и включая PAM и ниже и включая LE, в результате чего оставалась только последовательность между PAM и LE (т. е. сайт вставки). Длины результирующих прочтений были рассчитаны и использованы для построения профилей расстояния вставки PAM-LE.
Благодарности
Мы благодарим Л.Т. Хилле, C.R.R. Алвес и Р.А. Silverstein за предложения по рукописи, P.M. Boone за помощь с ddPCR и B.L. Стоддард за советом. C.J.T. был поддержан грантом № 2020295403 Национального научного фонда для аспирантов. BPK был поддержан стипендией Говарда М. Гудмана Mass General Hospital.
Ссылки
1.↵
Hendrie, P.C. and Russell, D.W. Нацеливание генов с помощью вирусных векторов. Молекулярная терапия 12, 9–17 (2005).
2.↵
Томас, К.Э., Эрхардт, А. и Кей, М.А. Прогресс и проблемы с использованием вирусных векторов для генной терапии. Nature Reviews Genetics 4, 346–358 (2003).
3.↵
Tellier, M., et al. Маринер и суперсемейство транспозонов ITm. Микробиолог. Спектр . 3, MDNA3–0033–2014 (2015)
4. ↵
van Opijnen, T. and Camilli, A. Секвенирование вставок транспозонов: новый инструмент для системного анализа микроорганизмов. Нац. Преподобный микробиол . 11, 435–442 (2013).
5.
Ханифорд, Д. Б. и Эллис, М. Дж. Транспозоны Tn10 и Tn5. Микробиолог. Спектр . 3, MDNA3–0002–2014 (2015).
6.↵
Пластерк, Р. Х. А., Изсвак, З. и Ивич, З. Инопланетяне-резиденты: надсемейство мобильных элементов TC1/моряк. Trends in Genetics 15, 326–332 (1999).
7.↵
Wilson, M.H., Coates, C.J. and George, A.L. Транспозон-опосредованный перенос генов Piggybac в клетках человека. Молекулярная терапия 15, 139–145 (2007).
8.↵
Мали, П. и др. РНК-управляемая инженерия генома человека с помощью cas9. Наука 339, 823–826 (2013).
9.↵
Cong, L. et al. Мультиплексная инженерия генома с использованием систем CRISPR/Cas. Наука 339, 819–823 (2013).
10.↵
Rouet, P., Smih, F. and Jasin, M. Экспрессия сайт-специфичной эндонуклеазы стимулирует гомологичную рекомбинацию в клетках млекопитающих. Труды Национальной академии наук 91, 6064–6068 (1994).
11.↵
Wang, H.H. et al. Программирование клеток с помощью мультиплексной инженерии генома и ускоренной эволюции. Природа 460, 894–898 (2009).
12.↵
Wang, H.H. et al. Разработка промотора в масштабе генома путем совместной селекции MAGE. Нац. методы 9, 591–593 (2012).
13.↵
Jiang, W., et al. Редактирование бактериальных геномов с помощью РНК с использованием систем CRISPR-Cas. Нац. Биотехнолог . 31, 233–239 (2013).
14.↵
Strecker, J. et al. Вставка ДНК под управлением РНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами. Наука 365, 48–53 (2019).
15.↵
Klompe, S.E. et al. Системы CRISPR-CAS, кодируемые транспозонами, направляют интеграцию ДНК под управлением РНК. Природа 571, 219–225 (2019).
16.↵
Vo, P. L. et al. CRISPR РНК-управляемые интегразы для высокоэффективной мультиплексной инженерии бактериального генома. Nature Biotechnology 39, 480–489 (2020).
17.↵
Vo, PL, Acree, C., Smith, M.L. & Sternberg, S.H. Беспристрастное профилирование продуктов транспозиции, управляемой РНК CRISPR, путем секвенирования с длинным считыванием. Мобильная ДНК 12, (2021).
18.↵
Saito, M. et al. Двойной режим CRISPR-ассоциированного самонаведения транспозонов. Сотовый 184, (2021).
19.↵
Strecker, J. et al. Ответ на комментарий к «Вставка ДНК под управлением РНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами». Наука 368, (2020).
20.↵
Мэй, Э. В. и Крейг, Н. Л. Переход от вырезания и вставки к репликативной транспозиции TN7. Наука 272, 401–404 (1996).
21.↵
Холодий Г.Ю. и др. Четыре гена, два конца и область res участвуют в транспозиции TN5053: парадигма для нового семейства транспозонов, несущих мероперон или интегрон. Молекулярная микробиология 17, 1189–1200 (1995).
22.↵
Сюй, С.-юн. Эндонуклеазы, специфичные для последовательности ДНК. Биомолекулярные концепции 6, 253–267 (2015).
23.↵
Гасюнас Г. и др. Рибонуклеопротеиновый комплекс Cas9-crРНК опосредует специфическое расщепление ДНК для адаптивного иммунитета у бактерий. Труды Национальной академии наук 109, (2012).
24.↵
Jinek, M. et al. Программируемая ДНК-эндонуклеаза с двойной РНК в адаптивном бактериальном иммунитете. Наука 337, 816–821 (2012).
25.↵
Hickman, A.B. et al. Неожиданное структурное разнообразие в рекомбинации ДНК. Molecular Cell 5, 1025–1034 (2000).
26.↵
Сюй, С. и Гупта, Ю.К. Природные эндонуклеазы HNH ленты цинка и инженерная эндонуклеаза надрезов цинковых пальцев. Nucleic Acids Research 41, 378–390 (2012).
27.↵
Стоддард, Б.Л. Самонаводящиеся эндонуклеазы из мобильных интронов группы I: от открытия до геномной инженерии. Мобильная ДНК 5, 7 (2014).
28.↵
McConnell Smith, A. et al. Генерация никирующего фермента, который стимулирует сайт-специфическую конверсию генов из самонаводящейся эндонуклеазы I-ani LAGLIDADG. Труды Национальной академии наук 106, 5099–5104 (2009).
29.↵
Takeuchi, R., et al. Оптимизация in vivo активности бифункциональной самонаводящейся эндонуклеазы и матуразы обращает вспять эволюционную деградацию. Nucleic Acids Research 37, 877–890 (2008).
30.↵
Querques, I., et al. Выбор и ремоделирование целевого сайта с помощью систем CRISPR-Transposon типа V. Природа (2021).
31.↵
Скалли-Ким, М., МакКоннелл-Смит, А. и Стоддард, Б.Л. Коэволюция самонаводящейся эндонуклеазы и ее целевой последовательности-хозяина. Журнал молекулярной биологии 372, 1305–1319 (2007).
32.↵
Гилпатрик, Т. и др. Направленное секвенирование нанопор с лигированием адаптера под контролем cas9. Nature Biotechnology 38, 433–438 (2020).
33.
Парк, Ю.Ю. и другие. Структурная основа для выбора сайта-мишени в системах транспозиции ДНК, управляемых РНК. Наука 373, 768–774 (2021).
34.
Чой, К.Ю., Спенсер, Дж.М. и Крейг, Н.Л. Регулятор транспозиции TN7 TnsC взаимодействует с субъединицей транспозазы tnsb и селектором мишени TNSD.